临床生物化学检验实验：实验七 改良赖氏法测定ALT.pptVIP

【测定方法概述】 改良赖氏法,根据2、4二硝基苯肼与产物丙酮酸生成丙酮酸-2、4二硝基苯腙在碱性环境下呈红棕色，求出丙酮酸的生成量。因该显色反应特异性差，α-酮戊二酸干扰大，在试剂配方中2、4二硝基苯肼和α-酮戊二酸的用量严重不足，造成该法精密度差。但因试剂成本低廉和仪器要求低，在我国基层单位还在采用。 偶联丙酮酸氧化酶法属于定时法，指示反应是Trinds反应，受到体内一些还原性物质的干扰，在可见光范围内比色，即适合自动化分析又适合手工操作，但因试剂成本高昂而很少使用。IFCC推荐法，是目前使用最多的方法。 IFCC推荐法的方法，克服了以上两类方法的缺点可成批自动化分析，在目前使用最多。 郑佳音 实验七 改良赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶 实验目的 1.掌握改良赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理，了解其校准曲线的设计特点。 2 熟悉IFCC推荐法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理 【组织分布】ALT广泛存在于多种器官中，含量最多的是肝脏，顺序为肝、肾、心、骨骼肌等。在肝脏ALT绝大多数存在于细胞质中，只有少量在线粒体中。 AST同样广泛存在于多种器官中，按含量多少顺序为心脏、肝、骨骼肌和肾，还有少量存在于胰腺、脾、肺及红细胞中，肝中AST大部分（70％）存在于肝细胞线粒体中。 【标本的采集、处理和贮存】红细胞中AST和ALT分别为血清含量的15倍与7倍，所以明显溶血标本不宜测此二酶，特别是AST。 一、概述 【临床应用】 根据此二酶在人体器官中分布情况，临床医生习惯将ALT、 AST用在诊断肝脏疾病，测定AST用于诊断AMI。在AMI时，不论在出现升高时间，还是升高持续时间，其变化介于CK和LD之间，无特殊价值，随诊断AMI的新试验日益增多，国外已建议不用。目前转氨酶测定主要用于肝胆疾病的诊断和鉴别诊断。还可进一步检测AST/ALT比值，反映肝损害的严重程度。在重症肝炎时比值上升，轻型肝炎，比值下降。 【测定方法概述】 测定谷氨酸或丙酮酸。测定谷氨酸以酶电极法作代表，因需特殊仪器目前尚未广泛使用。 测定丙酮酸的方法又可以分为三类： 以赖氏法为代表的定时法 以IFCC推荐法为代表的连续监测法 偶联丙酮酸氧化酶法 在这三类方法中，IFCC推荐法为参考方法，在目前使用最多。 赖氏法测定血清ALT原理 IFCC推荐法原理 生成红棕色的2,4-二硝基苯腙，λ=505nm。 在340nm连续监测NADH的下降速率，计算出ALT活性。 【改良赖氏法方法学评价】 1．重复性差： 因显色反应特异性差，α-酮戊二酸干扰大，在试剂配方中底物α-酮戊二酸用量严重不足。如一般采用2.0mmol/L的浓度，反应速度只有最大反应速度的65%，使产物生成量与酶的活性之间不能呈现良好的线形关系。 2,4-硝基苯肼在碱性溶液下也能显色，为了降低试剂空白的吸光度，试剂配方中的用量也严重不足。低浓度的2，4-二硝基苯肼使校正曲线弯曲呈非线性也影响测定结果。 产物旁路效应，即ALT催化生成的产物丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下而消耗，从而影响测定结果。 2．准确性差， ①线性范围狭窄； ②影响实验条件的因素多，而且不易控制，系统误差大 。 3．试剂稳定性差，基质液不易保存（易长菌），易失效，故保存期短。影响试剂的批间结果的一致性。 4. 操作简便，实验条件要求不高，便于基层医疗单位开展。 卡门氏单位与国际单位 卡门氏单位的定义： 血清1ml,反应液总体积3.0ml,反应温度25℃，波长340nm,比色杯光径1cm，每分钟吸光度下降0.001为1卡门氏单位。 代入以下公式：U/L=0.001/6220*106*3/1=0.48, 25℃/37 ℃换算关系=1:2.2 * 1.0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 2.基质缓冲液 :200mmol/L L-丙氨酸，2mmol/L α酮戊二酸 3.1.0mmol/L 2,4-硝基苯肼溶液 4.0.4mol/L NaOH溶液 5.2.0mmol/L丙酮酸标准液 6.721/722型分光光度计 【试剂与器材】 * 1．ALT校准曲线绘制 (标准曲线制备是反应原理的第二步 ) (1)按下表向各管加入相应试剂 操作步骤 加入物(ml) 1 2 3 4 5 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 2.0mmol/L丙酮酸标准液 0 0.05 0.10 0.15 0.20 基质缓冲液 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 2,4-二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，37℃水浴20min 0.4mol/LNaOH溶液 5.0 5.