免疫学实验：淋巴细胞的分离与计数.pptVIP

淋巴细胞的分离与计数 从小鼠脾脏分离淋巴细胞 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载 玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（ 0．1mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来 换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。 血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格 网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。 计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中 方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。 每一个大方格边长为1mm，则每 一大方格的面积为1mm2， 盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm， 所以计数室的容积为0．1mm3。 实验器材 Materials: 昆明小鼠 ( 20～24 g), RPMI-1640培养基 75% 酒精，加样器，吸头，血球计数板，试管，滤网，手术器械 实验步骤 昆明小鼠断颈处死。消毒打开腹腔，分离脾脏，置于培养皿中，加入少许培养基； 将脾脏剪成小块，加入少许培养基；在100目滤网上研磨； 将收集的细胞悬液于1500rpm离心5分钟； 弃去上清，加入3ml蒸馏水或Tris溶液混匀，静置40s以破坏RBC；然后加入2ml培养基混匀； 1500rpm离心5分钟，加入3-5ml培养基重悬细胞； 悬液进行适当稀释，如不浓，可不必稀释。 镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。 加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的菌液由盖玻片边缘滴一小滴（约10ul，不宜过多），让细胞悬液沿缝隙靠毛细渗透作用自 行进入计数室，一般计数室均能充满。注意不可有气泡产生。 显微镜计数：静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现太浓或太稀，需重 新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个细胞为宜。位于格线 上的细胞一般只数上方和右边线上的。 清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留细胞或其他沉淀 物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。 淋巴细胞浓度计算公式: 细胞数 = 4个大方格内细胞总数/4 ×104 × 稀释倍数（cells/mL）