免疫学实验：E花环形成试验.pptVIP

E花环形成试验 目的 掌握Ｅ花环形成试验的原理、结果判断及检测意义。 原理 人外周血Ｔ淋巴细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽相结合的受体，称为Ｅ受体。Ｅ受体可结合SRBC形成环样细胞团，是Ｔ细胞特有的表面标志。Ｅ花环形成试验通常用于检测Ｔ细胞数量以及判断机体的细胞免疫状况。 由于Ｔ细胞的异质性，其对SRBC的亲和力亦不同，因而Ｔ细胞可形成不同类型的Ｅ花环，如淋巴细胞与SRBC经37℃水浴后离心，再于4℃放置2h所形成的花环数即代表T细胞总数，称总花环（EtRFC）；淋巴细胞与SRBC按一定比例混合只经低速离心沉淀形成的花环称为活性花环（EaRFC）。EtRFC形成能力有明显的温度依赖性，37℃、30min后绝大多数与淋巴细胞结合的SRBC与之解离，少数不解离的花环称稳定性花环（EsRFC）。 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA） ELISA可定性及定量地测定抗原抗体的结合。 ELISA可对标本中的抗原或者抗体进行测定。 * E - Rosette Forming Cell Test 淋巴细胞转化试验 T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如PHA、ConA）或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可以反映机体的细胞免疫水平，因此，可作为测定机体免疫功能的指标之一。 淋巴细胞增殖反应既可通过形态学观察计数，也可用3H-TdR掺入法检测细胞内DNA合成量的增加，据此判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。。 形态学方法 T淋巴细胞在体外培养过程中受有丝分裂原如植物血凝素（PHA）等刺激后，可转化为体积较大的母细胞，胞浆增多而深染，核增大并可见核仁部分细胞可出现有丝分裂，计数转化细胞的百分率可反映机体的细胞免疫功能。 体外引起淋巴细胞转化的刺激物种类很多，可分为非抗原性刺激物和抗原性刺激物两类。 1．非抗原性刺激物如植物血凝系（phytoagglutinin，pha）、刀豆素a（concanavalina，cona）、美洲商陆（pokeweedmitogen，pwm）和脂多糖（lps）等，通称促有丝分裂原（mitogen）。其中lps刺激b细胞，pwm可刺激t和b两类细胞，pha和cona刺激t细胞增殖。 2．抗原性刺激物如破伤风类毒素、链球菌激酶、纯化蛋白衍生物（purifiedproteinderivative，ppd）和白色念珠菌等。同种异型组织抗原也可作为刺激物，例如hla，用混合淋巴细胞培养法观察器官移植中受体细胞对供体细胞的反应性实质上也是一种淋巴细胞转化试验。 非抗原性刺激物可使正常人外周血中的淋巴细胞引起转化，与机体是否对某种抗原致敏无关，因此属非特异的淋巴细胞转化。抗原刺激物的作用只能使相应致敏的淋巴细胞发生转化，因此转化率大大低于非特异性转化。通常应用最多的刺激物是pha，特异性抗原仅使已经相应抗原致敏的t细胞发生转化，转化率一般约5％～30％，而且需要培养4～5天。虽然t细胞对特异和非特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，诱发的分裂和增殖过程却是相同。因此根据非特异性促有丝分裂原激活t细胞增殖反应的程度，同样可推测t细胞识别特异性抗原增殖反应。目前淋巴细胞转化试验是判断t细胞功能的一项常用的非特异性体外免疫学检测指标。 结果判定： 1．淋巴母细胞的形态学标准是细胞核的大小，核与胞浆的比例、胞浆染色性及核的构造与核仁的有无。可以见到以下几种类型细胞。 成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为6—8μm，核染色质致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。 过渡型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约10—20μm，核染色质致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。 淋巴母细胞：细胞体积增大，约20—30μm，形态不整齐，常有小突出，核变大，核染色质疏松，有核仁1—2个，胞浆变多，常出现胞浆空泡。 其它细胞：如中性粒细胞在培养72h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。 2．淋巴细胞转化率的计算　按上述分类检查推片头体尾三部分，计数200个淋巴细胞，算出百分率。 转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞。在正常情况下，PHA诱导的淋巴细胞转化率为60%-80%，如为50%-60%则偏低，50%以下则为降低。 转化型淋巴细胞：图上方为一激活淋巴细胞，细胞体积大，胞核不规则，染色质稍疏松，胞浆缘可见伪足，下方有2个小淋巴细胞。 3H-TdR掺入法 原理 T细胞受PHA或特异性抗原刺激后，发