生化工程精品课件-固定化酶的性质.pptVIP

* * 生化工程 第三章 固定化酶反应动力学 堵国成 教授 第二节　固定化酶的性质 1.固定化酶活力 2.固定化酶的稳定性 3.固定化酶的催化特征 　　　酶经固定化后，活力大都下降，这是因为酶活力中心的重要氨基酸与水不溶性载体相结合，活力中心的结构起了变化，虽不会导致酶的失活，但酶与底物的相互作用受到空间位阻。 另外，在一些酶的固定化过程中，酶活性的下降可能是酶地固定化过程中有所变性导致。 　　为了提高固定化酶的活力，可在固定的同时加入酶活性中心保护剂，如底物、产物或其结构类似物等。 1.固定化酶活力 固定化酶活力的测定 　固定化酶活力测定基本上与溶液酶相似，也以反应初速度表示。即每毫克干重固定化酶每分钟转化1 umol底物量或生成1 umol产物的酶量为一个单位(umol/mg·min)。 　对于固定化的酶管、酶膜、酶板等，则以单位面积（cm2）的初速度来表示。 由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为正确。 在酶固定化操作中，当酶与载体结合后，用适量适当的缓冲液淋洗固定化酶，以洗除未固定的酶，收集洗脱液，并测定其中蛋白量(或酶活力)，即为残留的蛋白量(或酶活力)。 偶联效率 或: 酶经固定化后，一般会比溶液酶的活力有所下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分数称为活力回收。 活力回收和相对活力 固定化酶活力与同量蛋白量的溶液酶活力的比值，称为相对活力： 半衰期 在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。 　　半衰期是衡量固定化酶稳定性的一项重要指标。 　　　酶被固定化后，因酶分子结构或细胞被约束，有可能降低其对外部恶劣环境的敏感性，使其稳定性（如贮藏、对热、对各种化学试剂，对不易被蛋白酶类的分解）增加，甚至可大幅度地增加。 　　　即使在文献上一般不报道固定化后稳定性降低的研究，但因稳定性增加的报告比比皆是，能够充分地肯定，固定化后确定可使酶的稳定性增加。 2.固定化酶的稳定性 固定化方法对酶性能影响可能的原因： ①固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 可防止酶分子伸展变形； ②抑制酶的自身降解。 ③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶 的侵袭。 如：氨基酰化酶， 游离酶，70℃，15分钟，酶失去活性。 而固定化后， 70℃，15分钟，有80%活性。 　　　　 　　　酶被固定化后，反应的最适pH值、温度、动力学常数等可能与游离酶有所不同，甚至其固有的底物专一性可能受损。 　 3.固定化酶的催化特征 ● 底物专一性 当一种酶、细胞用水不溶性载体固定化后，由于空间位阻，酶对高分子量底物的作用活性显然减少，甚至不能催化作用。 　 ●反应的最适pH值 最适pH和pH曲线的变动，依固定化载体与酶分子、细胞上所分布电荷的相互作用不同而异。　有时最适pH变化而pH曲线形状不变，在特殊的情况下，可见到最适pH变动?pH＝2的例子。　 带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体 ：最适pH 向酸性偏移。 * *