生化工程精品课件-固定化酶反应动力学.pptVIP

1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器——葡萄糖氧化酶电极（第一代酶电极传感器）。 葡萄糖酶电极 ?-D-葡萄糖＋O2 D-葡萄糖酸-1，5-内酯＋H2O2 半透膜 酶胶层 感应电极 酶电极示意图 葡萄糖氧化酶 Glucose Gluconic acid Glucose oxidase Oxygen Hydrogen peroxide Membrane Electrode 根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。 　第二代酶电极传感器是采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子。第二代酶电极传感器可不受测定体系的限制，测量浓度线性范围较宽，干扰少。 　第三代酶电极传感器,即酶的氧化还原活性中心直接和电极表面交换电子的酶电极传感器。 　继酶传感器（enzyme sensor）后，又出现： 细胞器传感器（cell organelle sensor） 组织传感器（tissue sensor） 微生物传感器（microbe sensor） 免疫传感器（immunosensor） 　　目前已有的商品酶电极传感器包括: 葡萄糖氧化酶电极传感器、L－乳酸单氧化酶电极传感器、尿酸酶电极传感器等。 　在研究中的酶电极传感器则非常多。 酶传感器的原理 生物传感器 由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。 第三章 固定化酶反应动力学 堵国成 教授 　第三节 固定化酶反应动力学 　　　从溶液酶到固定化酶是一个很大的转变，这一转变给反应动力学带来的影响是复杂的。 　　　这里仅就固定化对酶反应动力学性态(或参数)和实际反应速度的影响做一粗浅的讨论。 (一)固定化对酶反应动力学参数的影响 1．构象改变 　　构象改变是指酶在固定化过程中发生了某种扭曲，影响了酶分子的空间结构，从而导致了酶与底物结合能力或酶催化底物转化能力的改变，见图。 溶液酶 效应物或底物 酶 固定化酶 构象改变示意图 2．屏蔽效应 　　　酶经固定化后，由于载体的存在，干扰与影响了酶与底物或其它效应物的结合，见图。 溶液酶 效应物或底物 酶 屏蔽效应示意图 固定化酶 3．微扰效应 由于载体的疏水、亲水及电荷性质，使得紧邻固定化酶的环境区域通常称为微环境发生变化而与宏观反应体系不同，从而使酶的催化能力及酶对效应物作出调节反应的能力发生改变。 宏观体系 微环境 宏观体系与微环境 4．分配效应 　　由于底物和其它各种效应物(包括H+与OH-)在微环境与宏观体系间的不等分布，使得酶反应速度发生变化。 5．扩散效应 　　　扩散效应是指底物、产物和其它效应物在酶的微环境区与宏观体系之间迁移速度的一种限制。它的直接结果也是使上述物质在这些区域分布不等。 扩散限制与底物、产物和其它效应物的分子量大小、载体的结构以及酶反应的性质有关。 　上述这些效应通常总是相互交叉、相互关联地存在着，它们综合在一起决定着固定化酶的动力学性质，见表。 “素质动力学参数”是指溶液酶或固定化酶本身固有的特征动力学参数。固定化酶相对溶液酶而言，增加了固定化对酶造成构象改变、屏蔽效应及微扰效应所产生的影响。 考虑到分配效应及扩散效应的影响，便得到”实效动力学参数”，它具有更为普遍和实际的意义，可通过实验加以测定。 固定化酶催化系统是一种非均相的反应系统，反应过程包括:(1)底物从反应液主体移向载体表面(底物外部扩散)、(2)从载体表面移向酶作用位点(底物内部扩散)、(3)底物被催化生成产物、(4)产物从反应位点移向载体表面、(5)再移至反应主体液等5个基本步骤。 反应达到稳态时，在最慢步骤的限制下，使各步骤的速度相同。其中最有可能成为限制性的步骤是外扩散或内扩散步骤。 (二)固定化对实际反应速度的影响 酶经固定化后，由于5个因素的影响，其实际反应速度Vp，往往要比理论上预期的反应速度低，通常用有效系数η来定量表示载体内部反应的有效程度。可用如下方程式表示： 式中：Vp表示单位体积固定化酶的实际反应速度； 　　　 Vs表示当载体内部底物浓度等于溶液中浓度时，单 位体积固定化酶的理论预期反应速度。 　　　通常情况下：0η≤1。 有效系数η的意义在于它可以作为衡量固定化酶有效作用的尺度。这是由于： 第一，只要知道溶液中底物浓度[s], 就可通过η来获得固定化酶的实际反应速度，而无需测定载体内的底物浓度。（从该速度表达式可见） 式中 V’max,、K’m