基因克隆步骤.docxVIP

总 RNA 提取 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将 1ml Trizol 加到离心管中待用 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置 5 min；打开离心机预冷 加 200 μL 氯仿，振荡 15 sec，室温放置 3 min，分层； (4) 4oC，12,000g，离心 15 min； (5) 取上清，加 500 μL 异丙醇，混匀，室温放置 10 min； (6) 4oC，12,000g，离心 10 min； (7) 弃上清，加 1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用 100%乙醇清洗 (8) 4oC，7,500g，离心 5 min； (9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加 50 μL DEPC 水，－80oC 保存。 此操作中所用到的器皿均需经过 DEPC 灭活 RNA 酶处理。提取的总 RNA 需经 RNA 电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260 值为核酸的吸收值，OD280 值为蛋白的吸收值，OD260/280 值在 1.8-2.0 间一般说明该核酸蛋白含 量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230 值为多糖和酚类的吸收值，比 较干净的核酸 OD260/230 值能达到 2.2 左右。RNA 浓度计算公式：总 RNA 浓度 （μg/mL）=A260×稀释倍数×40。 反转录/cDNA 第一链的合成 纯化 RNA 以去除基因组 DNA，操作按 TaKaRa 公司的 PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为： Total RNA 5× gDNA Eraser Buffer gDNA Eraser RNase Free dH2O 条件为：42oC，2min； RNA 纯化后，即可进行反转录。其体系为： 1μg 2μL 1μL 补齐至 10μL 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ RT Primer Mix 上一步的反应液RNase Free dH2O 操作条件为： 1μL 1μL 10μL 补齐至 20μL 37oC 放置 15 min； (2) 85oC，5 sec； (3) 4oC 保存。 PCR 按 TaKaRa 公司的 Premix Taq Version 2.0 操作，，PCR 反应体系如下： Premix Taq 模板 引物 1 (10 μM) 引物 2 (10 μM) ddH2O 25 μL 5μL 1 μL 1 μL 18μL PCR 反应条件为：94°C 预变性 5min；94°C 变性 30s，53°C 退火 30s，72°C 延伸 30s，循环 36 次；72°C 延伸 10min。 PCR 反应完毕，取 5μL 反应产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL 反应产物）。 基因克隆及测序 PCR 产物切胶回收 将 PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA 片段。使用 TIANGEN 公司的 Universal DNA Purification Kit 割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下： 平衡吸附柱：向吸附柱 CB2 中（吸附柱放入收集管中）加入 500μL 平衡液 BL，13,400×g 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2 重新套回收集管中； 按 100 mg agarose 胶加入 100μL 溶液 PC，置于 50oC 中 10 min 左右， 中途混匀几次，至胶完全融化； 将样品倒入一个吸附柱 CB2 中（吸附柱放入收集管中），室温下 13,400 ×g 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱 CB2 重新套回收集管中； 向吸附柱 CB2 中加入 600μL 漂洗液 PW（加乙醇），室温下 13,400×g 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱 CB2 重新套回收集管中； 重复上一步骤； 将吸附柱 CB2 放入收集管中，室温下 13,400×g 离心 2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干； 将柱子套入一新的灭菌 1.5 mL 离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 50μL 洗脱缓冲液，室温放置 2 分钟，13,400×g 室温离心 2 min，收集到的洗脱液即为回收的 DNA 纯化液； 取 5μL 的纯化液体进行 1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液 中 DNA 含量。 目的片段与载体连接 胶回收产物与 T 载体连接体系，参考 Takara 公司 pMD18-T 载体的试剂盒说明书。在灭菌的 0.5 mL 离心管中配制如下溶液（