DB15T 2555-2022原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法.docxVIP

ICS65.020.30CCS ICS 65.020.30 CCS B40 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2555—2022 原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法 Technical regulation of the isolation, primary culture and Technical regulation of the isolation, primary culture and identification of Bovine Mammary Epithelial Cells derived from fresh milk 2022-04-25 发布 2022-05-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。 本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、特日格勒、张兴夫、崔新洁、赵濛、云伏雨、张春华、羿静、康长清。 原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法 范围 本文件规定了乳汁分离法培养鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞的术语与定义、材料、仪器和试剂耗材、操作步骤等技术要求与规范。 本文件适用于从奶牛乳汁中分离培养和鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞。 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 原代奶 原代奶牛乳腺上皮细胞 primary bovine mammary epithelial cells 从奶牛乳汁或乳腺中分离、培养并鉴定出来的上皮细胞。 免疫荧光技术 immunofluorescence technique 又称荧光抗体技术，是以荧光物质标记抗体，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的检测和定位。 染色体组型分析 karyotype analysis 对不同生物的染色体组型（有丝分裂中期的染色体数目及其特征）进行定性和定量的分析和研究。 4 材 料 乳汁来源 泌乳前期（22 d～100 d）健康奶牛。 取样 用无菌水及75 %酒精擦洗奶牛乳房，挤牛乳约500 mL分装于灭菌的蓝盖瓶中，37 ℃保温瓶保温带回实验室。 仪器和试剂耗材 仪器 生物安全柜，CO2培养箱，高压蒸汽灭菌锅（137 ℃，0.25 MPa），普通光学显微镜，超低温冰箱 （-50 ℃～-86 ℃），PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，低速冷冻离心机（2000 g，-8 ℃～10 ℃），低温高速台式离心机（20000 g，-8 ℃～10 ℃），酶标仪，恒温水浴锅，倒置荧光显微镜（40 x～640 x）。 试剂与耗材 试剂 PBS缓冲液，0.25 %胰蛋白酶，细胞冻存液，0.4 %台盼蓝，MTT(0.5 mg/mL)，二甲基亚砜(DMSO)， 总RNA提取试剂盒，DNA水解酶，反转录试剂盒，PCR试剂盒，Taq酶，琼脂糖，4 %多聚甲醛，山羊血清 （10 %），兔抗人角蛋白8多克隆抗体，FITC标记的山羊抗兔IgG ，DAPI（10 μg/ mL），秋水仙素（5 μg/mL），0.2 %TritonX－100，10 %Giemsa染色液等。 配制溶液组分 完全培养液：10 %FBS+DMEM/F12+100 U青链霉素双抗+氢化考的松（1 μg/mL）+孕酮（1 μg/mL） +转铁蛋白（5 μg/mL）+胰岛素（5 μg/mL）+谷氨酰胺（200 mmol/L）+EGF（10 ng/mL）。核型分析固定液：甲醇：冰醋酸为3:1。 耗材 T25细胞培养瓶，96孔细胞培养板，90 mm培养皿，0.22 μM滤膜，15 mL/50 mL离心管，2 mL细胞冻存管，无酶PCR管，移液器，血球计数板等。 操作步骤 分离培养 分离 在生物安全柜中，将 200 mL 乳汁与含青链霉素双抗（100 U/mL）的 PBS 按体积比 2：1 混合后， 分装于 15 mL 无菌离心管中，500 g 离心 20 min，自上而下吸弃上层乳脂层及相邻乳白色浑浊层的一半。 向剩余液体中加入等量含青链霉素双抗（100 U/mL）的 PBS，再次 500 g 离心 15 min，自上而下缓缓吸弃大部分上清层，重复上述步骤，直至剩余 1 mL 左右。 将所有剩余液体收集于一个 15 mL 无菌离心管中， 等量 PBS 重悬，500 g 再次离心 5 min， 自上而下缓缓吸弃大部分上清层，重复上述步骤，直至剩余 1 mL 左右，即为乳汁中分离到的细胞层。 培养 向细胞层中加入5 mL完全培养液，接种于T25细胞培养瓶中，于37