霍奇金淋巴瘤实验设计.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * 霍奇金淋巴瘤中IκBα基因突变的研究 淋巴瘤：是原发于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤，可分为霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤两大类。临床上以无痛性淋巴结肿大为特征。 基因：是具有遗传效应的DNA片段。 基因突变：由于DNA分子中发生碱基对的增添，缺失或改变，而引起的基因构造改变。 研究背景 霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL，Hodgkin’s disease，）是恶性淋巴瘤的一个独特类型。 淋巴瘤：是原发于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤，可分为霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤两大类。临床上以无痛性淋巴结肿大为特征。 研究背景 其特点为：①临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散。原发于结外淋巴组织的少见。 研究背景 ②瘤组织成分多样，但HL特异性的病理改变为——大量反应性增生的背景淋巴细胞中可见少于1%Reed-Sternberg细胞（R-S细胞）。 这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞) 反应：活组织接受刺激后发生的功能改变。 细胞：是一切生物的形态结构和功能活动的基本单位；是构成生物有机体的基本结构单位；是代谢与功能的基本单位；是生物有机体生长发育的基本单位；是遗传的基本单位。 细胞：是一切生物的形态结构和功能活动的基本单位；是构成生物有机体的基本结构单位；是代谢与功能的基本单位；是生物有机体生长发育的基本单位；是遗传的基本单位。 研究背景 p53和bcl-2基因突变 EB病毒感染 但证据均不足，HL的发病机制 尚未明确 肿瘤细胞 基因：是具有遗传效应的DNA片段。 基因突变：由于DNA分子中发生碱基对的增添，缺失或改变，而引起的基因构造改变。 感染：病原微生物侵入宿主体内并引起病理变化。 病毒：由一个核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构成或仅由蛋白质构成的非细胞形态的靠寄生生活的生命体。 研究背景 有研究发现NF-κB (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。[1] IκBα作为重要的NF-κB通路抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。 抑制：细胞功能变化由强变弱的过程称为抑制。 研究背景 将对IκBα激酶 （IκBα kinase, IKK）无反应的IκBα突变体导入HRS细胞中可阻断NF-κB的活化，导致细胞凋亡，说明IκBα在HL发病机制中有重要作用。[2] 反应：活组织接受刺激后发生的功能改变。 突变体：细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为突变体。 凋亡：活体内个别细胞程序性细胞死亡的表现形式，是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序导致的细胞主动性死亡方式，在形态和生化特征上有别于坏死。 研究背景 Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IκBα mRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IκBα蛋白结构改变导致。[3] 结构：群落中所有生物及其个体在空间的配置情况 研究目的 本实验意在： ①了解IκBα基因在HL中突变的情况； ②分析经典型HL HRS中IκBα突变的特点、可能造成的蛋白结构异常； ③以及这些异常的病理意义，即其与HL发病的相关性。 结构：群落中所有生物及其个体在空间的配置情况 实验材料与试剂 霍奇金淋巴瘤组织样本 CD30单抗（Dako公司，克隆号Ber—H2，效价1：20） Leica ASLMD激光显微系统 PCR引物（北京赛百胜公司） PCR仪（包括反应体系） DNA测序仪 样本：以某方式按预先规定的概率从总体中随机抽取的足够数量的能够反映总体分布特征的一部分观察对象的某种指标值的集合。 克隆：通过无性方式，由单个细胞或个体产生的、和亲代非常相似的一群细胞或生物体。 实验流程 CD30免疫组化 激光显微切割和DNA 提取 IκBα基因扩增 PCR产物检测 待测基因外含子测序 免疫：指机体事变和排除非己抗原异物，以维护内部环境平衡和稳定的生理功能。其功能包括防御、自身稳定和免疫监视三方面。 CD30免疫组化 采用EnVision两步法。 将冰冻组织切成6μm厚连续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含0．05％ NP40的丙酮(v／v)固定10 min，室温下自然干燥； 免疫：指机体事变和排除非己抗原异物，以维护内部环境平衡和稳定的生理功能。其功能包括防御、自身稳定和免疫监视三方面。 CD30免疫组化 6％ H2O2-甲醇，37℃ 10 min，消除内源性过氧化物酶； 加1：20稀释的一抗； 加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。