免疫标记技术及分析应用.pptVIP

4.竞争法 * . 去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收 荧光抗体的纯化 * . 荧光显微镜 利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。 * . 荧光显微镜的种类 透射式 落射式 * . 细胞内双标记荧光染色 在同一标本中，可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行染色，同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同的抗原。 如：FITC（黄绿色荧光）标记Ab1— RB200或TRITC9（桔红色荧光）标记Ab2 * . DAPI+FITC FITC+PI （2）双色免疫荧光技术 如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI（红色）DAPI（蓝色） * . Enzyme Immunoassay（EIA） 第三节 * . 抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计 特异、敏感 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 * . 将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。 * . 一、常用的酶及其底物 酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。 常用酶 底物 显色辣根过氧化物酶 邻苯二胺、H2O2 橙黄色 四甲基联苯胺、 H2O2 蓝色碱性磷酸酶 对硝基苯磷酸酯 黄色 * . 二、 标记方法 酶结合物 技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。 * . 戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶 改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2-NH-IgG * . 三、酶标记物的纯化及鉴定 1、纯化 游离酶：增加非特异染色 游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色 葡聚糖凝胶层析法 50%饱和硫酸铵沉淀提纯法 * . 2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法 * . 四、酶标仪（酶联免疫检测仪） 比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温育、加样 450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm * . * . * . * . 免疫标记技术 放射物标记技术 酶标技术 免疫荧光技术 其他标记技术 酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术 双抗体夹心法 竞 争 法 双抗原夹心法 间 接 法 双位一点法 * . ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay * . ELISA基本实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色 * . ELISA原理图 ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） * . 固相抗原或抗体 1.固相载体的性状：聚苯乙烯等固相载体 2.试剂的配制:所有试剂的配制都用双蒸水 3.包被:(1)包被缓冲液:PH 9.6 碳酸盐缓冲液 (2)包被的浓度:10μg/ml(3)包被的时间：4℃过夜或37℃1-3h (4)包被的量: 100μl * . 酶 底 物 显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 橘红色黄色棕色兰色蓝绿色 492 460 449425642 碱性磷酸酶 4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS