核酸分子杂交 (2).pptVIP

核酸分子杂交技术（nucleic acid molecular hybridization）是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。 探针( probe )：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。 第三节 核酸分子杂交技术 第二十七页，共四十八页，2022年，8月28日 核酸分子杂交 ↓ 固相杂交 液相杂交 膜上印迹杂交 核酸原位杂交 核酸分子杂交的分类 第二十八页，共四十八页，2022年，8月28日 一、膜上印迹杂交 印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定 的固相支持物上的方法。 常用的固相支持物： 硝酸纤维膜（NC）、尼龙膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等 特点： 较强的结合核酸的能力（10μg/cm2） 指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。 第二十九页，共四十八页，2022年，8月28日 操作步骤： 预杂交 杂交 洗膜：洗去膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子的过程。 第三十页，共四十八页，2022年，8月28日 1．印迹方法 Mechanics of transfer 虹吸印迹法（Capillary） 真空转移法（Vacuum） 电转移法（Electrophoretic） Blot DNA to membrane 第三十一页，共四十八页，2022年，8月28日 Capillary Blotting (upward) no special equipment required! 1975年 E. Southern Southern DNA 印迹转移技术 DNA片段1kb，1小时 DNA片段15kb，18小时 第三十二页，共四十八页，2022年，8月28日 Electrophoretic blotting 不宜用硝酸纤维素膜 一般2~3小时， 最多6 ~8小时 especially good for small fragments resolved by PAGE 第三十三页，共四十八页，2022年，8月28日 2. 预杂交prehybridization 概念：为了减少探针与膜的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。 常用的封闭物： （1）变性的非特异性DNA:如鲑鱼精DNA、小牛胸腺DNA，又称为覆盖DNA。 （2）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400 、脱脂奶粉 第三十四页，共四十八页，2022年，8月28日 关于核酸分子杂交 (2) 第一页，共四十八页，2022年，8月28日 核酸分子杂交 是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 杂交分子：杂交后形成的异源双链分子 杂交双方分别称为探针与待测核酸。 目的:检测核酸序列 特点：高度的灵敏性(pg) 、高度的特异性 第二页，共四十八页，2022年，8月28日 应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。 检测对象: 克隆化的基因组DNA、细胞总DNA、总RNA。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。 第三页，共四十八页，2022年，8月28日 第一节 核酸分子杂交的基本原理 第四页，共四十八页，2022年，8月28日 DNA变性、复性与分子杂交 第五页，共四十八页，2022年，8月28日 Hybridization 第六页，共四十八页，2022年，8月28日 一、变性（denaturation） 二、复性（renaturation） 三、杂交（hybridization） 四、预杂交（prehybridization） 第七页，共四十八页，2022年，8月28日 一、DNA的变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开 成两条单链的过程。 方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、 甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。