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taqman法SNP基因分型引物设计及Primerexpressss教程会计学内容目录第1页/共10页一、 SNP引物、探针设计原则二、 primer express软件设计教程-以rs2243106为例一、 引物设计原则第2页/共10页扩增产物控制在50-150 bp，以便获得最大扩增效率。探针长度设计在13-25 bp，且位置不与上下游引物重叠。探针Tm值控制在65-67度，GC含量在30-80%。探针5端避免G，以免淬灭荧光基团.两条探针的Tm值相差不要超过1℃SNP位置应在探针的1/3-2/3处(5’-3’),必要时，可以移向3’端，但不可以放在最后两个碱基的位置上。SNP位置SNP位置必要时可以移向3’端SNP位置最好在探针1/3-2/3间但不可以在最后两个碱基第3页/共10页primer express软件设计SNP引物教程-以rs2243106为例1．SNP序列的获得（1）在NCBI的SNP数据库()中输入SNP号，可以很方便的获得位点信息，但显示的序列较短，无法用于设计引物。即：ACTATTGCTACACTCAGTTTCCCAA[C/T]TGCTCCTGTATAATCTTGTCTTCTG。如下图所示：第4页/共10页（2）因此，可以通过点击SNP号，进入SNP位点的详细信息页面中(左图)，点击”FASTA”小标签（红圈），获得SNP位点上下游序列信息。注意，SNP位点以兼并碱基的形式给出，即Y代表了C/T。（右图绿色字母）。将其全部复制下来。第5页/共10页2. 打开Primer Express软件，点击新建图标①，在type中选择taqman MGB Alleic Discrimination ②,点击OK①②第6页/共10页3. 之后，上图中黑色区域会变为白色活动工作页面；将在NCBI中复制的FASTA格式的序列全部粘贴进去。③因无法识别Y，该图标为灰色状态；在下一步骤会激活②②注意，Y也会被粘贴进去，但是软件不会识别这种复制粘贴进去的Y，需跟随下一个步骤，人工指定。第7页/共10页4. 人工指定SNP。选中上图中的Y，将其改为C①；再选中改好的C，此时，菜单栏中的图标②会亮起，点击图标后，软件会要求使用者根据多态性选择另一个碱基③，本例中其多态性为T；点击T后，选中的字母C会再次变回Y。此时，完成了指定SNP位点。②①③第8页/共10页5. 完成指定SNP位点后，会变回字母Y（红底），也就是指定SNP位点成功了。此时，就可以点击“绿色播放”按钮①，软件就会自动设计上下游引物和探针。①第9页/共10页6. 软件完成设计后，会生成下图结果报告。在candidate primersprobes中，可以方便的选择引物对，选定之后，可以点击sequence标签，查看所在的位置，或者点击order标签内底部的export，可以方便的输出，以便复制粘贴，用于合成引物。