TALENs的靶向基因修饰技术.pptxVIP

TALENs的靶向基因修饰技术会计学第1页/共14页简介基因组靶向修饰转基因技术诱变技术转录激活子样效应因子核酸酶技术（TALENs）生物应用模型构建RNAi技术反义吗啡林技术RNAi技术锌指核酸酶技术 第2页/共14页RNAi: 与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默的现象 其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降 解，产生干扰小的RNA（siRNA),这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性降解靶RNA从而抑制或者下调基因的表达。 转基因技术：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传修饰。 反义吗啡林技术：反义寡核苷酸抑制特定的信使RNA对蛋白质的翻译来控制基因的表达。简介第3页/共14页TALEN（ Transcription Activator-Like Effector Nucleases ）转录激活子样效应因子核酸酶TALENs 的靶向基因修饰技术是一种崭新的分子生物学方法，现已应用于植物、哺乳动物细胞、人类细胞、线虫、酵母、斑马鱼及大鼠等各类研究对象。TALENs技术特点：1. 无基因序列、细胞、物种限制。 2. TALE的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。实验设计 简单准确、实验周期短、成本低。 3. 成功率几乎可达100%。 毒性低、脱靶情况少。 4. 克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性。第4页/共14页简介 人们可以对基因组的特定位点进行各种遗传操作, 包括基因打靶、基因定点插入、基因修复等, 从而能够方便快捷地对基因组实现靶向遗传修饰。每周TALENs可识别并结合特定的 DNA 序列, 并通过切割这一序列的特定位点造成DNA的双链断裂(DSB)应用作用机制TALENs第5页/共14页结构及其构建TALE靶点识别模块构建第6页/共14页TALENs结构Fok I 核酸酶的切割结构域TALE蛋白的DNA结合结合域TALE蛋白是由黄单胞菌进入植物细胞分泌的,能识别并结合特异的 DNA 序列， Fok I 则可通过二聚化产生核酸内切酶活性, 在该序列附近造成 DNA 的双链断裂(Double-stand break, DSB)。TALE靶点识别模块构建第7页/共14页TALE是由12个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基 (RVDs)位点。TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基。 TALE靶点识别模块构建第8页/共14页单元组装法TALE靶点识别模块构建第9页/共14页为获得识别某一特定核酸序列的TALE，只须按照DNA序列将相应TAL单元串联克隆即可。由于物种基因组大小的不同，选择的特异序列长度也不同，对于哺乳类动物包括人类，一般选取16-20bp的DNA序列作为识别靶点。TALENs的作用机制第10页/共14页将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联,可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALENs。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔13-22碱基）的靶序列（一般16-20个碱基）分别进行TALE识别模块构建。 将这两个相邻靶点识别模块（分别）融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表达载体，得到TALEN质粒对。TALENs的作用机制第11页/共14页将TALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合， 由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近， 形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA， 形成DSB（Double-Strand Breaks），诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过NHEJ（Non-homologous End Joining）修复DNA， 在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。TALENs基因靶向修饰技术的应用第12页/共14页①建立生物模型。在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠、线虫、酵母，斑马鱼等的基因敲除模型也常见于报道。②疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。第13页/共14页谢谢！