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荧光定量 PCR完全攻略 荧光定量PCR 完全攻略 1、什么是定量PCR? 以参照物为标准,对PCR 终产物进行分析或对PCR 过程进行监测,从而达到评估样本中 靶基因的拷贝数,称为定量PCR.定量PCR 的可行性定量一般是在PCR 扩增的指数期进行的. 2 、定量PCR 定量的理论依据是什么? 特定的待扩增基因片段起始含量越大,则指数扩增过程越短,当扩增速率趋于稳定后, 则无论原来样品中起始模板含量多少,最终扩增片段的含量通常是一样的. 理想的扩增结 果:Y=X*2n 其中 代表扩增产物量, X 代表PCR 反应体中的原始模板数 n 为扩增次数; 理 论上PCR 扩增效率为 100%,PCR 产物随着循环的进行成指数增长,但实际上:DNA 的每一 次复制都不完全,即每一次扩增中,模板不是呈 2 的倍增长;实际应为:Y= X(1+E)n ,其中E 代表扩增效率:E = 参与复制的模板/总模板,通常E≤1,E在整个PCR 扩增过程中不是 固定不变的.通常X 在1~105 拷贝、循环次数n≤30 时,E 相对稳定,原始模板以相对固 定的指数形式增加,适合定量分析,这也就是所谓的指数期;随着循环次数n 的增加(30 次),E 值逐渐减少, 呈非固定的指数形式增加,最后进入平台期. 3 、荧光定量PCR 定量的理论模式又是什么? PCR 是对原始待测模板核酸的一个扩增过程,任何干扰 PCR 指数扩增的因素都会影响扩 增产物的量,使得 PCR 扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系,通 过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量.近年来研究人员通过大量的实践,研究了 相对准确的定量 PCR 方法,即荧光定量 PCR. PCR 扩增通式: ① Tn=T0(1+E)n ② Tn=Tn-1(1+E)n 注:[0E 1] 其中E 表示扩增效率,n 为循环数,Tn 表示在n 个周期后PCR 产物的数量,Tn-1 表示在n-1 个周 期后PCR 产物的数量,T0 为原始模板数量.设定PCR 到达指数扩增期时,产生一定的荧光(荧 光依赖于某一循环扩增产物的总量,即特定的拷贝数K,为常数,大约在 1010 左右)高于背 景为仪器所识别,此时的循环数为CP(crossing point), 也就是K= T0(1+E)CP ,取对数即: lg K=lg T0+CP*lg(1+E) CP=- 1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E) 由于对一特定的PCR 而言,E 与K 均为常数,故上式为循环数(CP)对原始模板拷贝数的对 热线电话:021-5446 0831 8009881995 E-mail:master@ 网 址: 1 数(lg T0)一次方程,其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为- 1/lg(1+E), 在横坐标上的截距为 lgk/lg(1+E),也是荧光定量PCR 所谓的标准曲线.例如下图为单管实时荧光定量RT-PCR 的标 准曲线: 目前荧光定量 PCR 均采用外标定量 外标法定量PCR 扩增效率的计算,由于标准曲线的斜率(Slope) 为- 1/lg(1+E),可知 E=10-1/Slope -1 ,如从标准曲线中知道Slope=-3.337, 则可推知扩增效率E=101/3.337 -1=0.99,也有作 者将(1+E)直接视为扩增效率E,则E=10-1/Slope ,求得的E 值均在 1—2 之间,有时也有大于 2 的结果,如下图所示.另外也可直接根据系列稀释外标在该次实时荧光PCR 的结果来大略分 析扩增效率的高低,例如系列 10 倍稀释外标在PCR 扩增时有N2=N0En2 , N3=(10*N0)En3 ,在扩 增到指数期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝数相同,即N2=N3,En2-n3 =10,取对数得到 ⊿n gE=1, E=10l 1/ ⊿n ,E=2,⊿n=3.32; E=1.8, ⊿n=3.91.反之亦然.如图所