荧光定量PCR引物设计要求(1).pdfVIP

荧光定量PCR 引物设计要求 荧光定量PCR引物的具体设计要求： 1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的 300-400bp 区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。 2. 产物不能形成二级结构( 自由能小于58.61KJ/mol) 。 3.引物长度一般在17-25 碱基之间,上下游引物不能相差太大。 4.G+C 含量在40%~60%之间，45-55%最佳。 5.碱基要随机分布，尽量均匀。 6.引物自身不能有连续4 个碱基的互补。 7.引物之间不能有连续4 个碱基的互补。 8.引物5′端可以修饰。 9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich 的区域，避开T/C,A/G 连续结构(2-3 个) 。 10. 引物3′端要避开密码子的第3 位。 11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于 9KJ/mol 。 可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。 12.做荧光定量产物长度80-150bp 最好，最长是300bp. 13.引物设计避免DNA 污染，最好跨外显子接头区。 14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8 个互补碱基同 源。 15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA 序列，与需要扩增的 目的片段长度相似。 16.TM 值在58-62 度之间。 17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。 ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAA GTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTT CGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGC TGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGG TGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAA GGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGC CAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCAC TCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG 5 GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3 5 GACCACAAAGTCAGCCCCAG 3 ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAA GTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTT CGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGC TGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGG TGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAA GGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGC CAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCAC TCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG 5 GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3 5 CAACAGTCTTTTGAGTGGCAG 3 5