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会计学 1 研究背景 实验材料与方法 实验结果 实验讨论 实验展望 致谢 内容 第1页/共21页 研究背景 3 第2页/共21页 研究目的及意义 4 第3页/共21页 血脑屏障 5 血脑屏障上重要的的蛋白质分子： 紧密与粘附连接蛋白 胞吞转运相关蛋白 基底膜蛋白 转运蛋白 血脑屏障是脑内的毛细血管内皮细胞彼此紧密相连，同时与周围的周细胞和星形胶质细胞相互作用形成的屏障系统。 第4页/共21页 研究背景 实验材料与方法 实验结果 实验讨论 实验展望 致谢 内容 第5页/共21页 实验材料 7 1、实验对象 成熟的正常雄性Wister大鼠，体质量210-280g，平均250g。 2、实验仪器 XXX提供 3、实验试剂 XXX提供 第6页/共21页 实验方法 8 动物分组：将30只大鼠随机分为6组，每组5只大鼠。 甲、乙、丙为实验组，A、B、C组为对照组，。 实验动物放疗：将分好组的大鼠，做好标记，喂养一段时间后，进行放疗实验。 将按体重给予实验组和正常组大鼠一定剂量的水合氯醛麻醉后（给予水合氯醛方法为腹腔注射），将实验组大鼠固定在预先制作好的板子上，将其头颈部放在放疗仪的放疗窗下，给予2Gy的剂量的照射，源皮距75cm，照射野约2.5cm ×2.5cm,上界位于唇部,下界位于颈部，左右露空，垂直照射，2Gy/次，5次/周。 实验动物取材：雄性成年大鼠在照射后16小时，实验组和对照组分别取大脑、小脑各一份，石蜡包埋，制备石蜡切片。 动物实验 大鼠放疗视野 第7页/共21页 实验方法 9 Western Blot（WB）实验 蛋白提取：称取冻在超低温冰箱中的脑组织，用离心管称取0.4g，加入事先配好的RIPA裂解液400uL后将其用破碎仪破碎后，匀浆后反复冻融三次（在液氮中冻，水中融化），用离心机将上述冻融的溶液离心后（12000r/min，10min），取上清液80uL加入小离心管中，加入20uL的蛋白上样缓冲液，用封口膜封口，在100℃热水中变性5min，后将其冻存在—20℃冰箱中。 将上述提取的蛋白分别做WB实验，分别做p-gp（P-糖蛋白）、Bcrp（乳腺癌耐药相关蛋白）、mrp2（多药耐药相关蛋白2）。 SDS电泳 一、配胶 8%分离胶（9.2ml蒸馏水、5.3ml 30％Acrylamide、5.0ml 1.5M 10％SDSTris-HCL（pH8.8）、0.2 ml 10％SDS、0.2ml 10%过硫酸铵、0.012ml TDMED） 浓缩胶（6.8ml蒸馏水、1.7ml 30％Acrylamide、1.25 ml 1.0M Tris-HCL（pH6.8）、0.1 ml 10％SDS、0.1ml 10%过硫酸铵、0.01ml TEMED） 二、电泳 样品准备：将蛋白样品从-80℃取出，在-4℃下解冻，涡旋离心，排好上样顺序。 上样：第一孔上3μL的maker,其余孔上所需的蛋白样品8μL。 电泳条件：80V恒压跑至分离胶，约为0.5h,然后用120V跑至结束约为2h。 第8页/共21页 10 三、湿法转膜 1.凝胶处理：取出电泳完的凝胶，切去浓缩胶及溴酚蓝指示带的下沿分离胶。 2.铺膜：按转印夹(黑)-海绵 -三层滤纸-凝胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-转印夹的顺序铺好。其中滤纸、PVDF膜均为4.5cm*8cm。 3.湿转条件：50V恒压下湿转3h10min。 四、膜的封闭 TBST溶液清洗3次，每次10min ，1.5％的脱脂牛奶中，室温摇动1h封闭。 五、一抗的孵育 TBST溶液清洗10min，用5％的脱脂奶粉将所需一抗稀释到合适的比例或用合适比例涂膜，放置室温2h或4℃过夜，完成后用TBST溶液清洗4次，每次10min。 六、二抗孵育 用5％的脱脂奶粉将所需二抗稀释到合适的比例，在室温将膜摇动1h后，用TBST洗涤4次，每次10min。 七、显色 配置发光液，先加白瓶溶液后加黑瓶溶液，将发光液涂在吸干水分的PVDF膜上，曝光。 实验方法 Western Blot（WB）实验 第9页/共21页 研究背景 实验材料与方法 实验结果 实验讨论 实验展望 致谢 内容 第10页/共21页 实验结果 12 一、放疗后XXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 第11页/共21页 实验结果 13 二、血脑屏障上的P-gp的表达 结论 ：XXXXXXX XXXXXXXXXXX XXXXX 第12页/共21页 实验结果 14 三、血脑屏障上的Bcrp的表达 结论 ：XXXXXXX XXXXXXXXXXX XXXXX 第13页/共21页 实验结果 15 四、血脑屏障上的Mrp2的表达 结论 ：XXXXXXX X