实验三血清γ球蛋白的分离纯化及鉴定七年制.pptxVIP

会计学;【实验目的】 1．学习盐析法、凝胶层析和离子交换层析分离纯 化蛋白质的基本原理及应用 2．掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用 3．了解蛋白质分离纯化的总体思路; 【实验方法】 一、盐析法粗分γ-球蛋白 二、凝胶过滤方法脱盐 三、离子交换层析方法纯化γ-球蛋白 四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度 ;【基本原理】 蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一。 不同蛋白质的分子量、溶解度及在一定条件下，带电的情况等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。;;【基本原理】 本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤、离子交换层析方法，分离纯化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度。 ;7;一、盐析法粗分离血清γ-球蛋白;定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。 原理: 破坏蛋白质两个稳定因素： 水化膜和电荷层 中性盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。 优点：蛋白质不变性，常用。;盐析步骤;二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐 ;凝胶层析原理：P31;凝胶层析法脱盐;凝胶柱层析脱盐;分子筛层析;数学模型 ;17;18;▲ Sephadex G-25的准备 ▲ 装柱（15~20cm）;▲ 加样与洗脱;脱盐;⑤.层析后洗脱液检测;注意事项： 1 . 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。 2. 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。;三、DEAE－纤维素离子交换层析 ;离子交换层析的基本原理;DEAE－纤维素离子交换层析纯化γ－球蛋白;操 作;１.使用离心机的操作注意事项。 ２.装柱时检查是否漏水。 ３.装柱后凝胶均一无断层，无气泡，柱床面平整。 ４.柱床面保持有缓冲液。 ５.加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。 ６.每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样品交叉污染。;四、γ－球蛋白纯化液的浓缩 ;五、γ－球蛋白鉴定 ;蛋白质的电离示意图 ;基本原理; 血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳;;醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 ;醋酸纤维素薄膜电泳;操作步骤：;; 按泳动快慢顺序分为：清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白??;注意事项： 1、区分电泳槽正负极。 2、点样处放在负极端，保持膜水平。 3、点样面朝下，以防样品蒸发。