蛋白质和多肽的氨基酸序列分析.pptVIP

二、肽链的部分降解 三、肽段的分离提纯 第三节 亚基拆离、肽链降解和肽段的分离 一、亚基拆离和二硫键的断裂 第八十七页，共一百三十页，2022年，8月28日 一、亚基拆离和二硫键断裂 蛋白质由一条以上的肽链组成时，肽链间的结合可能是靠非共价键结合，也可能是靠共价键结合。在进行肽链顺序分析时，首先要将它们分离开来。 若多亚基间以非共价键连接，在温和条件下即可以拆离亚基，如改变溶液pH，将pH降低到3～4或升高到9～10；或者加入变性剂，如8 mol/L 尿素或6 mol/L 盐酸胍等。 例如，血红蛋白经8 mol/L 脲处理后，α及β链可以得到分离；核酮糖二磷酸羧化酶在0.2 mol/L 巯基乙醇及1% SDS溶液中保温1小时，大小亚基便相互分开。 拆离后的亚基可以用凝胶过滤方法进行分离。 第八十八页，共一百三十页，2022年，8月28日 拆分 靠共价键结合的因比较牢固须用特殊的化学作用使其破坏。 最常见的是半胱氨酸残基经氧化作用而形成胱氨酸残基，即二硫键结构。 第八十九页，共一百三十页，2022年，8月28日 1．过甲酸氧化法 优点：能将巯基（-SH）和二硫键（-S-S-同时氧化成磺基，生成的磺酸基很稳定，肽链不再重新形成二硫键，便于肽链分离。 缺点：氧化过程中，同时将蛋磺酸的侧链氧化成亚砜，色氨酸的侧链也遭破坏。 第九十页，共一百三十页，2022年，8月28日 2．还原法 一般可使用过量巯基化合物，如β-巯基乙醇。在室温或pH 8～9条件下放置数小时，即可使二硫键还原成巯基。 加入8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍使蛋白质变性。在这种情况下，还原剂才能有效地作用于暴露的二硫键。 二硫键还原后，需要用巯基保护试剂，如碘乙酸，以防其重新被氧化。 第九十一页，共一百三十页，2022年，8月28日 2、PTC-AA 实验操作：氨基酸或样品在Eppendorf管中真空干燥后溶解在50 ul偶联试剂(乙醇:三乙胺:水＝7:1:1)中。此溶液在旋转真空干燥后再次溶解于50ul偶联试剂中，然后加入2ul PITC(异硫氰酸苯酯)，反应混合物在250C下保温15 min，再次旋转真空干燥，真空度(1.3~13 Pa)。如此生成的PTC-AA溶解在适量流动相A中，取一部分上柱定量分析。 第五十五页，共一百三十页，2022年，8月28日 仪器为Beckman Gold System HPLC仪，反相柱RP-18 (250mm×4.6mm)或PTH-柱，254 nm 检测。 流动相： A 50mmol/L 乙酸钠，pH6.8 B 50mmo1／L乙酸钠，pH6.8:乙腈＝50 : 50 HPLC柱采用水浴夹套40℃恒温，并用5％流动相B平衡。 梯度条件是：0 min ,5%B, 5 min, 5％-15％B, 10 min,15％B；30 min, 15％~60％B, 40 min, 60 ~ 5％B 流速是1ml／min。 第五十六页，共一百三十页，2022年，8月28日 第五十七页，共一百三十页，2022年，8月28日 3、茚三酮法 实验操作：水解后氨基酸样品溶解于Na-S样品稀释液中100 u1上样分析，实际进样量50 ul(100 pmol~5nmol，均呈线性)。 第五十八页，共一百三十页，2022年，8月28日 仪器：Beckman 6300氨基酸分析仪。 流动相： Na-E 0.0 min 温度： 0.0 min 48℃ Na-D 27.80 min 11.8min 65 ℃ Na-F 39 min 32.5min 77℃ Na-R 76.00 min 50min 48 ℃ Na-E 77.00-90 min 流速： 缓冲液14 ml/ h 茚三酮7 ml/ h 第五十九页，共一百三十页，2022年，8月28日 第六十页，共一百三十页，2022年，8月28日 第二节蛋白质的末端测定 第六十一页，共一百三十页，2022年，8月28日 蛋白质的末端分析的目的: 确定其氨基末端残基及羧基