酶工程-实验2碱性磷酸酶的反应动力学性质.pptxVIP

实验二 酶的反应动力学性质一、实验目的了解影响酶促反应速度的因素。学习测定米氏常数（Km）的原理和方法。二、实验原理碱性磷酸酶在碱性条件下，催化磷酸单酯水解，通过测定催化反应速度确定酶活力。根据米氏方程E+S←→ES→E+P可推导出米氏公式υ=υmax[s]/(Km+[s]) 通过测定不同底物浓度[s]下的反应速度υ，可以确定催化的最大反应速度υmax和米氏常数Km 。通过在不同pH、温度、激活剂和抑制剂条件下，测定酶活力，可确定pH、温度、激活剂和抑制剂对酶催化作用的影响。 三、实验材料、仪器和试剂（一）实验材料与仪器15mL试管；pH计；恒温水浴锅；分光光度计；玻璃/石英比色皿；移液枪与移液管。（二）主要试剂碱性磷酸酶；PNPP溶液；1M Tris-HCl缓冲液（pH8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）；二价阳离子溶液：MgCl2溶液；CaCl2溶液；ZnCl2溶液四、实验内容 1、底物浓度对酶反应速度的影响——υmax和Km的测定取5支试管，各加入0.5mL酶液和1mL pH9.5、1M Tris-HCl缓冲液，于30℃恒温5min，再分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mM PNPP溶液0.5mL（事先保温5min），于30℃反应10min，分别测定反应前后的OD420 。2、pH对反应速度的影响取5支试管，各加入酶液0.5mL，pH为10、9.5、