DNA重组之目的基因的分离.pptVIP

大肠杆菌 革兰氏阴性菌 细胞表面的结构和组成与革兰氏阳性菌不同 转化因子的吸收较为困难 人工制备感受态细胞 4. 转化过程 第三十一页，共六十三页。 大肠杆菌的转化方法： Ca 2＋诱导大肠杆菌转化法 电穿孔转化法 三亲本杂交接合转化大肠杆菌 第三十二页，共六十三页。 1、Ca 2＋诱导大肠杆菌转化法 培养生命活动旺盛的菌体 菌种分纯活化，扩大培养，处于对数生长期 沉淀菌体 冰水浴中预冷10分钟，4 ℃离心 化合物处理 含CaCl2 无菌预冷缓冲液处理 DNA分子转化感受态细胞 第三十三页，共六十三页。 制备感受态细胞的注意事项 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或 －20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 第三十四页，共六十三页。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降