(15)--5-重组DNA导入宿主细胞生物技术制药.pptVIP

基因工程菌的构建-重组DNA导入宿主细胞 学习目标理解并识记基因工程常用宿主细胞类型理解并区分重组DNA分子导入宿主细胞常用方法利用所学知识，选择实际操作中使用的导入方法 1基因工程常见宿主细胞及常用方法2重组DNA导入细菌3重组DNA导入酵母4重组DNA导入哺乳动物细胞目录CONTENTS 01-常见宿主细胞宿主细胞原核细胞真核细胞大肠杆菌枯草杆菌乳酸菌沙门菌链霉菌酵母菌昆虫细胞植物细胞哺乳动物细胞 01-导入常用方法常用方法物理方法生物方法化学方法显微注射、电穿孔等转化、转染等病毒感染等转化：通过含外源基因的重组质粒将外源基因直接导入宿主细胞中转染：重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体等介导下进入真核细胞的过程感染：重组病毒载体入侵受体细胞而导致的病理生理过程 02-重组DNA导入细菌常用方法：化学转化法、电转化法、感染法化学转化法菌体培养至对数期，离心收集菌体；用冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体；用冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体； 冰浴放置12 - 24小时，备用。 大肠杆菌感受态细胞的制备：感受态细胞加入质粒冰浴42℃热激冰浴加入培养基摇床孵育涂板培养 02-重组DNA导入细菌电转化法将待转化的质粒或DNA重组分子连接液滴加在电穿孔转化仪的样品池中两极施加高压电场在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。以λDNA或者黏粒作为载体构建重组DNA包装进含有外壳蛋白的颗粒中，成为具有感染能力的噬菌体颗粒感染细菌并在细菌中扩增感染法 03-重组DNA导入酵母常用方法：电转化法、化学转化法、原生质体转化法电转化法使用YPD培养基培养酵母取0.1-0.5ml 过夜培养物，转接在新鲜培养基中，过夜生长至对数期4 度，1500g离心收集细胞,用预冷的灭菌水悬浮细胞离心，预冷的灭菌水悬浮细胞离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞离心，用1 ml 预冷的1M山梨醇悬浮细胞感受态细胞的制备：感受态细胞置于电转杯，加入重组酵母载体DNA电击加入山梨醇培养 03-重组DNA导入酵母化学转化法培养酵母细胞至对数期离心收集菌体使用含乙酸锂缓冲液重悬菌体加入质粒及含有聚乙二醇4000的缓冲液30℃培养42℃热激涂板培养 03-重组DNA导入酵母原生质体转化法早期酵母菌的转化采用此方法在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%操作周期长转化效率受到原生质再生率的严重制约一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33% 04—重组DNA导入哺乳动物细胞优点：哺乳动物细胞表达系统的表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然高等生物蛋白质分子缺点：基因转移效率低常用方法：物理方法、化学方法、生物方法物理方法显微注射法电转化法 04—重组DNA导入哺乳动物细胞化学方法常用转染法DNA-磷酸钙转染法脂质体介导的基因转染法二乙氨乙基-葡聚糖转染法重组质粒含有目的基因的氯化钙溶液与含有哺乳动物细胞的磷酸盐缓冲溶液混合，形成白色沉淀复合物，粘附于细胞膜表面外源DNA与二乙氨乙基-葡聚糖复合物形成复合物，通过内吞作用进入哺乳动物细胞；瞬时转染 04—重组DNA导入哺乳动物细胞生物方法病毒感染法：携带目的基因的病毒经过外壳蛋白包装成为成熟的病毒颗粒，通过感染途径将目的基因导入到哺乳动物细胞内常用病毒：逆转录病毒慢病毒腺病毒腺相关病毒 总结常见宿主细胞分类化学方法物理方法生物方法基因工程重组DNA导入宿主细胞 感谢聆听