(11)--质粒酶切及PCR鉴定生物化学与分子生物学实验.pptVIP

质粒酶切及PCR鉴定 1.掌握PCR的原理及应用2.熟悉重组质粒鉴定的方法实验目的 存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的 小型环状DNA分子具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物经改造后具有多克隆位点。质粒 制性核酸内切酶：基因工程的手术刀是分子生物学研究中的一种工具酶，能识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。酶 切识别序列通常属于回文结构 XbaⅠTAGATCCTAGA T+TCTAGAAGATCT粘端切口AAGCTTTTCGAAA AGCTTTTCGA A Hind Ⅲ 酶切体系：10×Buffer 2μl（10μmol/L）HindⅢ 0.5ulXba Ⅰ 0.5ulDNA 0.5-1ug(5ul)ddH2O 12ul总体积 20ul混匀，37℃ 水浴1-2h。 HindIII插入基因1.7kbXbaI6.4kb 利用DNA半保留复制原理和DNA的变性和复性的特性，在DNA聚合酶、引物、模板和底物存在下，实现 DNA的体外扩增。 PCR技术的基本原理: PCR鉴定根据插入目的基因片段设计引物，进行鉴定。Xba ⅠHind Ⅲ 1.7KB6.4KB产物500bp引物 5?Primer 15?Primer 2Cycle 2Cycle 15?5? 5?5? 5? 5?Template DNA5?5? 5?5?5? 5? 5?5?基本工作原理 Cycle 35?5? 5?5?5? 5? 5?5?5? 5? 5?5? 5?5?5? 5?25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 实验原理模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+ PCR体系基本组成成分(要素) 模 板单/双链DNA或RNA都可以进行PCR，但如果样品是RNA，则需要先反转录成cDNA，然后再进行PCR，此称为反转录PCR。PCR对模板的纯度要求不太严格。一般102～104拷贝数的模板即可满足各种PCR反应。模板DNA中目的序列所占比例越高，非特异产物越少。 Taq DNA聚合酶在其它参数最佳时，Taq DNA聚合酶用量为1-2.5U/100μ1时效果最佳。Taq DNA聚合酶用量过多不但造成浪费，还可使非特异产物增加，靶序列扩增产物降低；过低时，则靶序列产量很低。 酶的最适用量可根据不同的模板分子或引物而变化。最好在100μ1反应体积中加入0.5-5U酶试验最佳酶浓度。 引 物 PCR反应产物的特异性由一对上、下游引物 决 定的, 引物是PCR成败的关键。引物设计原则：引物的长度以15-30bp为宜。引物中的碱基分布是随机的，尽量避免相同碱基的连续排列。（G+C）的含量在45-55%，引物的Tm值可用公式计算：[Tm=4(G+C)+2(A+T)]，Tm值高于55℃。避免两引物间的互补，以免形成引物二聚体。引物一定要与模板DNA配对；引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他非目的DNA有高度互补，才能使用。 ??dNTPs等2mmol/L dNTP贮备液：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4种脱氧核苷酸。 10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl(pH 8.4，20℃)，（150mmol/L MgCl2 ），1mg/ml明胶。Mg2＋，150mmol/L MgCl2 PCR体系Template 50-100ng(1ul)引物 (F+R, 10uM) 1.0μl（10μmol/L）PCR MIX 18μl（10μmol/L）总体积 20ulbuffer，dNTPs,Taq DNA聚合酶 PCR的基本反应步骤变性95?C延伸72?C退火Tm-5?C 94℃, 2min94℃, 30S55℃, 30S72℃, 30S72℃, 10min25 cyclesPCR扩增条件: 实验流程构建酶切体系构建PCR体系PCR仪扩增紫外观测仪观察结果琼脂糖凝胶电泳37 ℃水浴1h 22 Page注意事项1.构建PCR反应体系注意DNA污染2.制备琼脂糖凝胶时使用微波炉注意安全 感谢聆听