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分子生物学基因工程与基因体外表达;目的与意义;基本要素;Main contents ;For Example ;For Example ;FPS 克隆： RT-PCR， 3-RACE， 5-RACE;mRNA: 5’ AAAAAA3’;;Thank You;DNA重组 DNA recombination;第12页/共124页;三大理论基础;三大技术发明;1978年Nobel 医学与生理学奖;;DNA ligase repairing chromosomal damage.
ligase I, DNA, ATP-dependent;第一节 基因克隆是利用工具酶进行操作;一、RE在基因克隆中用于切割DNA;Restriction enzyme Functions:
能识别DNA内部特异位点并且裂解磷酸二酯键
(1) Sorting of restriction enzyme
有三型，但最重要的是II型酶
(2) Naming of RE ;Two catalytic manganese ions (one from each monomer) are shown as magenta spheres and are adjacent to the cleaved sites in the DNA made by the enzyme (depicted as gaps in the DNA backbone). ;(3) 限制酶的识别和切割位点
Characters:
通常识别4~6个碱基，少数识别8个
所识别的序列一般为回文结构(palindrome)
在特异位点内切割DNA双链，产生两种末端 ;5’-GGTGAATTCAGC…-3’
3’-CCACTTAAGTCG…5’;(4) 同工异源酶( isoschizomers )
来源不同，但能识别和切割同一位点的RE
例：Bam H I Bst I ( G↓GATCC)
Xho I Pae R7 (C↓TCGAG)
(5) 同尾酶( isoaudamers )
识别序列不同，但产生相同粘性末端的RE
例：Bam H I ( G↓GATCC)
Sau 3A I ( N↓GATCN)
RE作用的条件：
一定的盐溶度；Mg2+; 不需ATP
RE识别序列长度与切点数：
对同一DNA，识别序列短的，切点数多，片段较短；反之则反之;二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶;常用：
(1) DNA polymerase I，Klenow Fragment
(2) Reverse transcriptase
(3) T4 DNA ligase
(4) Alkaline phosphatase
(5) Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT
(6) Taq DNA polymerase
So on ;(1) DNA polymerase I
Activities：
5’→3’聚合活性， 5’→3’及 3’→5’外切活性
Functions：
在生物体内，填补引物切除后留下的空缺，修复
在生物体外，缺口平移制备探针;Klenow片段;常用的reverse transcriptase:;第二节 基因克隆需要特定的DNA载体;DNA载体(vector)----能与DNA片段连接，构建成新的重组DNA分子，并可携带该外源DNA片段进入一定宿主细胞，在宿主中扩增甚至表达，并有遗传标记进行筛选;;Expression vector: 含表达调控有关的元件;一、常用克隆载体主要来自质粒和病毒;pBR322;pUC19 ;(二) 噬菌体经过重组也可以携带外源 DNA;λ bacteriophage, phage
λ噬菌体是侵犯细菌的病毒。在菌体内为环状DNA分子；分离产物为双链线状DNA分子，有天然的粘性末端（称COS位点），进入宿主菌后可自行环合。基因组DNA长约为48.5Kb,共有66个基因，较复杂。;置换型λ噬菌体载体：用限制酶切除中央片段供目的基因替代，目的基因与左、右载体两臂结合。
替代片段可达9~23Kb。;The life period of λ phage(噬菌体的生活周期):;;λ gt10:insertion vector; multiple cloning site: CI;(四) 粘性质粒适合克隆较大的DNA片段;Characters:
1) With antibioti
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