【CN109810951A】一种从活性污泥中提取富集噬菌体的方法【专利】.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 109810951 A (43)申请公布日 2019.05.28 (21)申请号 201910280829.4 (22)申请日 2019.04.09 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 俞卓栋　张智明　朱亮　徐向阳　 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 傅朝栋　张法高 (51)Int.Cl. C12N 7/00(2006.01) 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (54)发明名称 一种从活性污泥中提取富集噬菌体的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从好氧颗粒污泥中高效 提取富集噬菌体的方法。该方法按照以下步骤进 行：(1)污泥研磨；(2)胞外多聚物水解；(3)超声/ 涡旋震荡(4)上清液提取；(5)二级超滤浓缩；(6) 样品保存固定。该方法操作简便，反应条件温和， 无有毒试剂使用，可有效解决颗粒污泥体系由于 EPS包裹产生的提取效率低下，细菌胞溶导致的 宿主DNA污染等问题，是一种高效可行的噬菌体 提取方法。相比于传统使用PEG和盐析结合提纯 噬菌体的方法相比，无需使用PEG和NaCl等药剂， 提纯时间有原来24h缩短至6h左右，且所得样品 盐浓度低，无需进一步透析除盐，所得的浓缩液 可直接用于透射电镜，DNA提取，CsCl 梯度离心 A 2 1 等相关操作。 5 9 0 1 8 9 0 1 N C CN 109810951 A 权　利　要　求　书 1/1页 1.一种从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1：使用细胞研磨器研磨污泥样品，使污泥样品分散； 步骤2：对步骤1处理后的样品利用糖化水解酶进一步水解，去除污泥样品中的EPS，降 低EPS对噬菌体释放的影响； 步骤3：对步骤2处理后的样品采用超声和涡旋震荡交替进行的方式，将附着在污泥细 菌表面的噬菌体分散到液相中； 步骤4：对步骤3处理后的样品进行离心分离，取离心后的上清液过0.22μm无菌滤膜，去 除游离细菌； 步骤5：对步骤4得到的滤液利用DNA降解酶Dnase  I去除宿主菌污染； 步骤6：对步骤5处理后的滤液，利用50kDa的超滤离心管进行一级超滤浓缩；然后采用 30kDa超滤管对一级超滤浓缩液进行二级超滤浓缩，得到噬菌体富集液； 步骤7：对最终富集液根据后续用途进行保存固定。 2.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤1中，污 泥样品在研磨前，需取污泥样品测定其MLVSS，作为生物量的基本指标。 3.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤3中，超 声和涡旋震荡交替重复十轮；每轮超声时间为2min，旋涡震荡时间为10s，超声和旋涡震荡 时间间隔为2s，超声功率为25W。 4.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤4中，离 心分离时离心机转速为3000rpm，离心时间为30分钟。 5.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤5中，滤 液中添加的Dnase  I浓度为2000U/L，酶解反应时间为3h。 6.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤6中，进 行一级超滤浓缩时，先将步骤5处理后的滤液定量转移至50kDa的超滤