凝胶层析法分离蛋白质.pptxVIP

凝胶层析法分离蛋白质;凝胶层析法分离血红蛋白和溴酚蓝 ;【目的】; 【原理】; 凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。 单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。;带网孔的葡聚糖珠;凝胶层析过程示意图;总结： 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。;【实验器材】;【实验试剂】;【操作方法】;二、装柱 A, 将层析柱垂直固定在铁架台上，关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高，若不漏则证明柱完好。 B,将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等；用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内，此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱； C,当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝胶完全沉降； D,凝胶柱上始终覆盖一层溶液，凝胶柱用洗脱液流过。;装柱注意事项： （1）装柱前加入1cm洗脱液，检查柱子 （2）凝胶装柱要一次完成。 （3）柱中的凝胶一定要浸没在洗脱液中。 （4）装凝胶的烧杯不能清洗。（看似脏的 东西都是凝胶）。;三、加样与洗脱 先打开下口开关，放出凝胶柱面上的溶液（或吸取，但溶液面不能低于凝胶表面），然后加样，控制流速，使样品渗入凝胶内。 本实验样品为：血红蛋白和溴酚蓝混合样品0.75mL(血红蛋白：溴酚蓝=2:1），用移液管滴加在液面下（不能冲起凝胶柱，也不能沿管壁流下），样品下渗至凝胶面时，关闭下口，完成上样，再加一层洗脱??（3～5cm）。 调整洗脱装置使滴入洗脱液滴速率与流出液滴速率一致。;四、收集 用试管收集洗脱液。 五、凝胶柱的处理 凝胶用过后，用洗脱液通过柱（2~3倍床体积）即可。 注意：需回收！！！ ;注意事项;感谢您的欣赏