第二章动物细胞大规模培养和专用生物反应器.ppt

1、吸附法: 用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法（adhesion）。操作简便、条件温和、是动物细胞固定化中最早研究使用的方法。 缺点：载体的负荷能力低，细胞易脱落。微载体培养和中空纤维培养是该方法的代表，稍后专门介绍。 第三十一页，共七十四页，2022年，8月28日 2、共价贴附法: 利用共价键将动物细胞与固相载体结合的固定化方法称为共价贴附法（attachment by covalent bonding）。此法可减少细胞的泄漏，但须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。 第三十二页，共七十四页，2022年，8月28日 3、离子/共价交联法: 双功能试剂处理细胞悬浮液，会在细胞间形成桥而絮结产生交联作用，此固定化细胞方法称为离子/共价交联法（cross-linking by covalent bonding）。交联试剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。 第三十三页，共七十四页，2022年，8月28日 4、包埋法: 将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法称为包埋法（entrapment）。 优点：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞泄漏少，抗机械剪切。 缺点：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常用载体为多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白。 第三十四页，共七十四页，2022年，8月28日 石蜡切片中底部薄层软蜡包埋法 甲基丙烯酸甲酯包埋标本 微囊型包埋法 第三十五页，共七十四页，2022年，8月28日 5、微囊法（microencapsulation）: 用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。微囊直径控制在200-400μm为宜。 第三十六页，共七十四页，2022年，8月28日 第三十七页，共七十四页，2022年，8月28日 第二节 大规模培养技术的操作方式 深层培养可分为: 分批式 流加式 半连续式 连续式 连续式 灌注式 第三十八页，共七十四页，2022年，8月28日 一、分批式培养（batch culture） 较早期的方式，采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养 一次性收获细胞、产物、培养基。 特点: 操作简单，培养周期短，染菌和细胞突变的风险小 直观反映细胞生长代谢的过程。 可直接放大。 第三十九页，共七十四页，2022年，8月28日 细胞的生长分：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期五个阶段。 分批培养的周期多在3-5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48-72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗竭或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。 第四十页，共七十四页，2022年，8月28日 二、流加式培养（feeding culture） 细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。 第四十一页，共七十四页，2022年，8月28日 1、流加培养物的方式 流加的时间通常在指数生长后期，细胞进入衰退期之前，添加高浓度的营养物质。可以添加一次，也可添加多次，凡是促细胞生长的物质均可以进行添加。流加的总体原则是维持细胞生长相对稳定的培养环境，营养成分既不过剩而产生大量的代谢副产物造成营养利用效率下降而成为无效的利用；也不缺乏导致细胞生长抑制或死亡。 第四十二页，共七十四页，2022年，8月28日 2、流加工艺中的营养成分（三大类）： ●葡萄糖：供能物质、碳源物质，浓度较高则产生大量的代谢产物乳酸，因而需要控制浓度，以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳。 ●谷氨酰胺：供能物质、氮源物质，需要控制浓度。 大规模培养中细胞凋亡，谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因。 ●氨基酸、维生素及其他：必需氨基酸、非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羟脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养成分如胆碱、生长刺激因子。 第四十三页，共七十四页，2022年，8月28日 三、半连续式培养（semi-continuous culture）