基因工程蛋白质类药物.pptxVIP

基因工程蛋白质类药物第1页/共21页 细胞因子是指机体细胞合成和分泌的小分子多肽类因子，它们具有调节机体的生理功能和免疫功能，因而有可能利用基因工程技术进行生产，用于治疗肿瘤、感染、免疫低下、造血功能障碍等疾病。目前已研制成功或正在研制的基因工程细胞因子类药物主要有促红细胞生成素(EPO)、集落刺激因子(CF)、干扰素（IFN）、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子、生长因子（GF）和凝血因子（F）等。一、基因工程细胞因子类药物第2页/共21页 基因重组人促红细胞生成素（erythropoietin,EPO） EPO是最早发现并首先运用于临床的造血生长因子， 1985年成功表达了重组人促红细胞生成素(rhEPO)。rhEPO成为当前研究开发最成功的基因工程药物。EPO是一种主要由肾脏和中枢神经系统等部位合成分泌的多功能糖蛋白激素, 是作用于红系祖细胞的造血生长因子，对神经元的许多功能也具有重要的调控作用。 在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌 。EPO的产生与机体供氧状况有关，低氧可刺激EPO的产生。第3页/共21页 EPO的分子结构和功能天然存在的 EPO 分为两种类型 , α型含 35 %的糖基 ,β型含 26 %的糖基。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类 EPO 含有 166 个氨基酸 ,相对分子质量为34 400 , hEPO上有4个半胱氨酸(7,29,33,161),在7—161，29—33之间以二硫键相连, 这对维持hEPO的生物学活性有重要作用。糖基化对稳定 EPO 的体内活性具有重要作用 ,若缺乏糖链 ,则 EPO 在体内迅速被水解而失活。第4页/共21页 促细胞生成素的生物学作用EPO 主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化以调控红细胞的生成。促进系祖细胞的增殖、分化和成熟调控神经元部分功能对细胞内钙浓度也有明显的调节作用第5页/共21页 人促红细胞生成素基因重组天然的 hEPO制品一般是从贫血病患者尿中提取的，所以药源极为匮乏，不能满足需要。因此，在20世纪80年代就开始rhEPO的研究，从胎儿肝中克隆出 hEPO基因, 并研制成功 rhEPO。1985年美国FDA 批准rhEPO作为治疗肾性贫血的药物。研制rhEPO的主要环节包括: 获得人促红细胞生成素基因和建立重组人促红细胞生成素的有效表达系统等。第6页/共21页 获得EPO基因构建基因组噬菌体文库克隆EPO基因　血细胞中提取基因组DNA→BamHⅠ酶切→回收酶切片段→插入噬菌体EMBL3载体中→构建基因组噬菌体文库→PCR方法从基因组模板中扩增EPO基因片段为探针→筛选完整EPO基因的插入片段→克隆人工化学合成的方法获得EPO基因：对部份氨基酸序列进行修改利用PCR技术扩增EPO基因：人胎肝中提取总mRNA →RT-PCR技术克隆hEPO基因第7页/共21页 重组人促红细胞生成素的表达系统为了获得分子结构和生物学活性与天然 EPO相似的rhEPO，选用哺乳动物细胞表达系统，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达系统、非洲绿猴肾细胞COS7表达系统、幼仓鼠肾（BHK）细胞表达系统。目前国内外首选CHO 细胞表达系统用来表达生产rhEPO。 CHO细胞表达系统 ：CHO细胞表达系统能准确进行转录后重组蛋白的加工修饰，表达的糖基化蛋白在分子结构和生物学活性方面与天然蛋白十分接近。 CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，而表达的外源产物是胞外分泌的，这样便于产物的下游分离纯化；在CHO细胞内重组基因能高效扩增和表达；CHO细胞贴壁生长，且具有较高的耐受剪切和渗透压能力，可以进行悬浮培养。昆虫细胞表达系统、乳腺表达系统 第8页/共21页 促红细胞生成素临床应用肾功能衰竭所致的贫血：这种病只有靠连续输血维持生命，但输血又使病人面临病毒感染和血过量的危险。EPO右刺激红细胞生成，免去慢性肾衰竭病人的输血。癌性贫血：肿瘤引起的贫血或接受化疗、放疗所引起的贫血。 结缔组织病贫血：类风湿性关节炎和红斑狼疮所致的贫血。骨髓增生异常综合征贫血：促进骨髓造血状况改善。第9页/共21页 重组人促红细胞生成素治疗的不良反应rhEPO在治疗各种因素所引起的贫血中疗效是肯定的，并且长期应用无毒性、无器官功能障碍、无过敏反应或抗体形成。但是也存在一些副作用，最常见的是血压升高，有的疾病治疗过程中还出现静脉血栓形成、出现高钾血症、头痛、水潴留等。应该特别强调，虽然使用促红细胞生成素能提高红细胞的含量，可增强人体的机能，但长时间或大剂量使用会产生上述严重的副作用，千万不要将此药作为兴奋剂。国际奥委会早在20世纪80年代就已宣布运动员禁用EPO来提高运动成绩。但是近年来仍有一些运动员滥用rhEPO，成