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实验二蛋白质的性质实验一第1页/共14页 2023/6/132实验二 蛋白质的性质实验（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应第2页/共14页 2023/6/133实验目的了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。N 端C 端第3页/共14页 2023/6/134 定量测定蛋白质的方法：凯氏定氮法双缩脲法茚三酮法Folin-酚（lowry法）考马斯亮蓝G250法紫外吸收法第4页/共14页 2023/6/135实验原理尿素 双缩脲 紫红色络合物双缩脲反应第5页/共14页 2023/6/136双缩脲反应 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。 在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540—560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。实验原理第6页/共14页 2023/6/137实验原理在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。 此反应为一切蛋白质和α-氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。 含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。第7页/共14页 2023/6/138实验原理黄色反应 蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀加热则白色沉淀变成黄色再加碱颜色加深呈橙黄色这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化产生了黄色硝基苯衍生物( 硝醌酸钠）。绝大多数蛋白质均含有芳香族氨基酸，因此都有黄色反应硝基酚(黄色) 邻硝醌酸钠(橙黄色)第8页/共14页 2023/6/139实验原理考马斯亮蓝反应 考马斯亮蓝G250在酸性溶液中以游离形式存在(呈棕红色)，当与蛋白质通过疏水作用力结合后变为蓝色。它的染色灵敏度比氨基黑高 3 倍，反应速度也快(~2 min 内即可达到平衡点)。在 0.01~1.0 mg Pr 范围内，[ Pr ] 与 A595 nm 值成正比。第9页/共14页 2023/6/1310实验仪器及试剂考马斯亮蓝G2500.5%苯酚浓硝酸0.1%茚三酮尿素1%硫酸铜2%卵清蛋白溶液第10页/共14页 2023/6/1311实验步骤双缩脲反应 取少量尿素结晶于干燥的试管中，用微火加热熔化 → 尿素重又开始硬化时停止加热 → 可见到氨气释出 → 冷却后加入 10% NaOH 溶液约 1 ml，振荡混匀 → 加 1 % CuSO4 溶液 1 滴，振荡 → 观察颜色变化取 1 ml 卵清蛋白溶液于干燥的试管中 → 加 10% NaOH 溶液约 2 ml，摇匀 → 加 1 % CuSO4 溶液 2 滴，随加随振荡 → 观察颜色变化 茚三酮反应取两只试管，分别加入 2% 的卵清蛋白溶液和0.5% 的 Gly 溶液 1 ml → 各加 0.5 ml 0.1% 的水合茚三酮溶液，混匀 → 在沸水浴中加热 1~2 min → 观察颜色变化在一小块滤纸上滴一滴 0.5% 的 Gly 溶液 → 风干 → 在原处滴一滴 0.1% 的茚三酮-乙醇溶液 → 将滤纸在微火旁烘干 → 观察颜色变化第11页/共14页 2023/6/1312管号123456材料(滴)鸡蛋清溶液 4 滴指甲少许头发少许0.5% 苯酚4 滴0.3% Trp4 滴0.3% Tyr4 滴浓硝酸(滴个试管出现黄色后，在室温下逐滴加入10% NaOH 溶液至碱性，观察颜色变化 .现象解释黄色反应第12页/共14页 2023/6/1313管号试剂12蛋白质溶液?(ml)00.1蒸馏水(ml)10.9考马斯亮蓝染液?(ml)55现象解释考马斯亮蓝第13页/共14页 感谢您的欣赏第14页/共14页