食品生物化学实验指导 课件 第二章 糖类 实验二 还原糖和总糖的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法）.pptx

实验二 还原糖和总糖的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法） 一、实验目的掌握还原糖和总糖定量测定的基本原理，学习比色定糖法的基本操作；熟悉721型分光光度计的使用方法。 二、实验原理各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。在碱性条件下，还原糖将3，5-二硝基水杨酸还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它产物，在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅的程度呈一定的比例关系，在540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。多糖水解时，在单糖残基上加了一分子水，因而在计算中须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9 即为实际的总糖量。 三、实验试剂与器材1. 实验材料：面粉。2. 实验器材：25mL 血糖管或刻度试管、大离心管或玻璃漏斗、100mL烧杯、100mL三角瓶、100mL容量瓶、移液管、水浴锅、离心机、电子天平、分光光度计。3. 试剂：6mol/LHCl、6mol/LNaOH、1mg/mL葡萄糖标准液、3，5-二硝基水杨酸试剂、碘-碘化钾溶液、酚酞指示剂。 三、实验试剂与器材1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取 100 mg分析纯葡萄糖（预先在 80 ℃烘至衡重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移至100mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。3，5-二硝基水杨酸试剂（DNS）：将6.3g 3, 5-二硝基水杨酸和262mL 2mol/L NaOH 溶液，加到500mL含有185g酒石酸甲钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL 蒸馏水中。酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL 70％乙醇中。 四、实验步骤1. 制作葡萄糖标准曲线取7支具有25mL刻度的血糖管或试管，编号，按下表所示的量，精确加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液和3，5-二硝基水杨酸试剂。 四、实验步骤 四、实验步骤将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，则向每管加入21.5mL蒸馏水，混匀）。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1-6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。 四、实验步骤2. 样品中还原糖和总糖的测定：（1）样品中还原糖的提取准确称取2g食用面粉，放在100mL的烧杯中，先以少量的蒸馏水调成糊状，然后加50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。离心或过滤，用20mL蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。 四、实验步骤（2）样品中总糖的水解和提取准确称取1 g食用面粉，放在100mL 的三角瓶中，加入10 mL 6mol/L的HCl及15mL 蒸馏水，置于沸水浴中加热水解30min。取1~2 滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已水解完全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入一滴酚酞指示剂，以6mol/L NaOH中和至微红，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液全部收集在100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。精确吸取10mL定容过的水解液，移至另一个100mL的容量瓶中，定容，混匀，作为总糖待测液。 四、实验步骤（3）显色和比色取5支25mL刻度的血糖或刻度试管，编号，按下表所示的量，精确加入待测液和试剂。 四、实验步骤 五、实验结果与分析以管①、②的吸光度平均值和管Ⅰ、Ⅱ的吸光度的平均值，分别在标准曲线查出相应的还原糖质量（mg）。按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。还原糖（％）=（还原糖毫克数×测定时取用体积/提取液总体积）/样品质量×100％总糖（％）=（水解后还原糖毫克数×稀释倍数）/样品毫克数×0.9×100％ 六、思考题1. DNS方法测定原理是什么？2. 总糖和还原糖的公式是如何推导出来的？ THANKS谢谢