食品生物化学实验指导 课件 第六章 酶 实验二 过氧化氢酶米氏常数测定.pptx

食品生物化学实验指导;CONTENTS;1.掌握测定米氏常数的原理和方法。 2.学习并掌握一般的数据处理方法。 ;底物浓度影响遵循米氏方程，如下式所示。 当底物浓度远远小于Km，增加底物浓度，反应速度增加，反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度远大于Km时，公式近似为ν=Vmax，反应速度不再增加，表现为零级反应。 酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法，例如，固定反应中酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km和Vmax是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。因此，通常情况下，都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即双倒数方程：;用1/V对1/[S]作图，即可得一条直线，该直线在纵轴上的截距为1/Vmax，在横轴上的截距即为1/Km的绝对值，斜率为Km/Vmax。如图所示：;0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）、25％H2SO4。 0.01mol/L KMnO4：称取KMnO4 1.6g，加蒸馏水1000mL，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。 0.05mol/L H2O2：30％ H2O2 23mL加入1000mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。;1. 酶液I的提取。 称取马铃薯40g，加入磷酸缓冲液80mL，充分匀浆后，过滤 。 2. 反应速度的测定。;计算出有关数据，在坐标纸上作图求出Km。;1.测定米氏常数有何意义？ 2.米氏常数的测定会受到哪些实验条件的影响？ ;THANKS