化学发光磁酶免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体西北大学硕士学位毕业.pptxVIP

第1页/共42页化学发光磁酶免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体西北大学硕士学位毕业第2页/共42页Contents1. 背景介绍2. 实验部分3. 全文总结西北大学 第3页/共42页梅毒 ● 梅毒螺旋体 ● 严重性传播疾病 ● 发病率不断上升 2010年4月国家卫生部全国法定 传染病疫情报告： 全国乙类法定传染病发病第３位梅毒检测：●孕前检查 ●供血者血液常规筛选检查西北大学 第4页/共42页西北大学 医院常用梅毒螺旋体免疫学检测方法快速血浆反应素环状卡片实验试验（RPR）和甲苯胺红试验(TRUST)初筛 假阳性高 判断主观梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）和梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA） 确认 判断主观 操作繁琐 要求严格梅毒ELISA实验灵敏度有待进一步提高 第5页/共42页梅毒螺旋体抗体化学发光法检测 灵敏度极高 自动化免疫分析系统（抗原、抗体，免疫反应）化学发光免疫分析技术化学发光分析系统（酶的化学发光底物或氧化剂）★免疫分析高特异性及化学发光高灵敏度于一体西北大学 第6页/共42页第7页/共42页第8页/共42页磁性微粒●比表面积大●分散性好●易分离●灵敏度更高聚乙烯酶标板●板表面包被面积有限●反应空间有限●灵敏度受限化学发光固相载体的选择西北大学 第9页/共42页GoldMag-AS微米金磁微粒1.生物分子固定化容量大 2.超顺磁性，易分离 西北大学 金磁微粒化学发光检测方法第10页/共42页实验原理包被反应检测西北大学 第11页/共42页HRP标记抗原稀释液的确定1包被抗原最佳用量及酶标抗原最佳工作浓度的确定2样本稀释液的确定保护剂的选择34第一部分 方法的优化西北大学 第12页/共42页HRP标记抗原稀释液的确定降低非特异性吸附 ： 加入非特异性蛋白与表面活性剂a PBST+20%小牛血清b PBST+0.1%BSAc PBST+0.5%BSAd PBST+1%BSAe PBST+1.5%BSA阴性样本的发光值西北大学 第13页/共42页包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的确定最佳抗原包被量：210ng/孔；最佳酶标抗原工作浓度：1：3000 抗原包 被量(ng/孔)酶标抗原稀释度 701402102803501:2000PN660271652562954603945677336671:3000P N21742744571735502494644947601:4000PN13746543501538501816563171541:5000PN1404247850118142554342943341:6000PN12142319386574249434201927西北大学 第14页/共42页样本稀释液的确定阳性血清稀释倍数检测结果1×PBS生理盐水PBS+0.1%BSA 正常人血清1:25++++1:50++++1:100++++1:200++++1:400++++1:800++++1:1600++++1:3200++++1:6400+ -+ -++1:12800--++1:25600--+ -+ -1:51200----最佳样本稀释液：PBS+0.1%BSA检测灵敏度与正常人血清相当西北大学 第15页/共42页保护剂的选择保护剂X对HRP标记抗原的保护作用良好HRP标记抗原置于37℃、放置6天西北大学 第16页/共42页保护剂X对包被抗原金磁微粒的保护作用稳定性很好包被抗原金磁微粒置于37℃、放置6天西北大学 第17页/共42页保护剂Proclin300与保护剂X的对比实验选定浓度为0.05%的Proclin300作为保护剂西北大学 第18页/共42页保护剂Proclin300对HRP标记抗原的保护作用含0.05%Proclin300的 HRP标记抗原置于37℃、放置6天西北大学 第19页/共42页第一部分实验小结 在初步建立的化学发光检测梅毒螺旋体抗体方法的基础上进一步优化，确定各最佳工作条件如下：1. HRP标记抗原稀释液：PBST+1% BSA作为HRP标记抗原稀释液；2. 抗原包被量：210 ng/孔(7 μg/mg )；3. 酶标抗原稀释浓度：1: 3000时，发光强度达到最佳；4. 血清样本稀释液：PBS+0.1%BSA；5. 保护剂：浓度为0.05%Proclin300的PBS缓冲液。西北大学 第20页/共42页参考值稳定性1452对比实验标准曲线63第二部分 实验方法的评价特异性精密度西北大学 第21页/共42页稳定性将阳性血清分别稀释50倍、100倍、200倍、400倍后进行检测化学发光试剂分别置于4℃冰箱和37℃生化培养箱中放置6天西北大学 第22页/共42页精密度次数检测结果阳性检测平均值RSD（%）1PN5423155735236249156057155747