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凯氏定氮法测定食品中蛋白质 当前第1页\共有27页\编于星期五\3点 一、概述 蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子的含氮化合物，它是由20种氨基酸通过酰氨键以一定方式结合，并具有一定的空间结构。 * 当前第2页\共有27页\编于星期五\3点 1 生命的物质基础 3 遗传信息的表达方式 5 人及动物需要从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质 2 维持酸碱平衡、水平衡 4 维持物质的代谢及运转 6 营养指标、食品生产工艺指标。 生理功能及在食品中的作用 当前第3页\共有27页\编于星期五\3点 常见食物中蛋白质的含量 牛肉 螺旋藻 * 当前第4页\共有27页\编于星期五\3点 常见食物氮系数 氮系数：蛋白质含氮量的倒数，常用6.25表示。 * 当前第5页\共有27页\编于星期五\3点 蛋白质测定方法 * 当前第6页\共有27页\编于星期五\3点 二、凯氏定氮法测定蛋白质（粗蛋白） 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。 1.原理 1 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出 2 样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵 3 加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸溶液滴定 当前第7页\共有27页\编于星期五\3点 消化 蒸馏 吸收、滴定 计算 2.实验步骤 当前第8页\共有27页\编于星期五\3点 第一步：样品消化 样品与浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水并破坏有机物，C、H氧化为二氧化碳、水逸出，蛋白质分解为氨、与硫酸结合生成硫酸铵、留在溶液中 对原子的前处理，使被测物质进入溶液中，使不溶变为可溶、有机物分解为可溶性无机物 消化 当前第9页\共有27页\编于星期五\3点 （1）消化 总反应式： 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%） * 当前第10页\共有27页\编于星期五\3点 消化装置 “自动回流消化仪” 当前第11页\共有27页\编于星期五\3点 定氮消化的不同状态 RCH2(NH2)COOH+H2SO4→CO2+H2O+SO2+ (NH4）2SO4 澄清 消泡 碳化 当前第12页\共有27页\编于星期五\3点 消化过程中试剂作用 硫酸钾：提高溶液沸点、加快反应进程； 硫酸铜（蓝绿色）：催化作用 褐色 当前第13页\共有27页\编于星期五\3点 (NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O 第二步——蒸馏 当前第14页\共有27页\编于星期五\3点 01 氢氧化钠需过量、若不够，会生成H2S,H2S是强酸，会使溶液颜色变红 02 防止样液中氨气逸出。 注意事项： 当前第15页\共有27页\编于星期五\3点 (3）吸收与滴定 吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸溶液 滴定：盐酸标准溶液， 硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 硫酸、盐酸溶液也可用作吸收剂。 当前第16页\共有27页\编于星期五\3点 各步骤操作细节图解： 样品消化→蒸馏→滴定 （1）样品消化 样品+0.4g硫酸铜+6g硫酸钾+20ml浓硫酸+玻珠数粒 先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸30分钟 45度角 消化终点 瓶口不能对着人 盖上小漏斗 * 当前第17页\共有27页\编于星期五\3点 （2）蒸馏 将消化液全部转移 到100ml容量瓶中 加10ml硼酸溶液和混合指示剂2～3d 加入NaOH溶液后颜色为深蓝色或褐色 通入蒸汽开始蒸馏 冷凝管下口浸入硼酸溶液中 取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。 * 当前第18页\共有27页\编于星期五\3点 吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端，取下接收瓶，关闭电源 * 当前第19页\共有27页\编于星期五\3点 （3）滴定 取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫酸标准溶液滴定至终点。 滴定前 滴定终点 同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。 * 当前第20页\共有27页\编于星期五\3点 * 仅滴定需要人工完成