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实验二电泳的学习材料第1页/共23页 人的IgG由两条重链（heavy chain, H链）和两条轻链（light chain, L链）组成，H和L链上有可变区（variable region,V区）和恒定区（constant region,C区），它们之间以二硫键相连。在加SDS的电泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的巯基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。第2页/共23页 特异性抗体检测相应抗原条带 酶标二抗第一抗体被测抗原封闭物 电泳分离的蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，不同的几何形状代表不同种类的蛋白质。一抗(兔抗人IgG )识别人IgG重链并与其结合，再用过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔IgG )与一抗结合，最后加入过氧化物酶的底物，酶催化底物产生有色、不溶性的产物，沉积在人IgG的重链带上。根据颜色的深浅和面积，可以估计被测蛋白的量。第3页/共23页 信号放大作用间接检测法： 二级抗体可测定多种多样的一级抗体从而避免了逐一标记一级抗体; 一抗通常能与几个二抗分子结合，从而起了信号放大的作用。Western印迹法检测蛋白的敏感性为1-5ng。缺点：是一抗可能会与二抗发生交叉反应，产生非特异性条带；检测过程增加了额外的温育步骤。第4页/共23页 二、实验目的通过蛋白质标准曲线求出IgG重链的分子量检测人体患病状态下IgG蛋白含量的差异第5页/共23页 两个胶条分别处理宽胶条考马斯亮蓝R250染色窄胶条转印后免疫染色人血清标准蛋白人血清 三、实验步骤第6页/共23页 染色、脱色 将宽胶条放到培养皿中，用蒸馏水清洗后，加入约10ml考马斯亮蓝R-250染色液染色1小时左右，然后换成脱色液脱色，不时摇动。更换几次脱色液，至背景无色透明，条带清晰为止。第7页/共23页 制备“转移三明治”1.切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液或水浸泡5min使之湿润。2.准备2张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。3.打开转移槽的胶板，依次放入： a.一张浸湿的海绵。 b. 一张浸湿的滤纸。 c. 用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的气泡。 d. 硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向。 e. 一张浸湿的滤纸。 f. 一张浸湿的海绵。第8页/共23页 转移电泳槽的夹板第9页/共23页 转 移 . 小心地合上胶板，按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移电泳槽中，加转移缓冲液至满。第10页/共23页 转移电泳装置 插好电极，打开电泳仪开关调至稳压60V，电泳1h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。目标蛋白质越大，时间越长 第11页/共23页 膜的酶联免疫染色1、封闭：用TBS缓冲液洗膜1min后，将膜封入塑料薄膜袋内，留一开口。加封闭液1ml(0.2ml/cm2)后封闭开口，37℃摇床上摇动30-50min。第12页/共23页 封口机的操作加热指示灯加热时间调节旋钮第13页/共23页 加封闭液及抗体2、与第一抗体结合(1)弃封闭液，加入适当稀释的1ml第一抗体溶液(兔抗人IgG)，封口后37℃摇床上轻轻摇动50min。(2)取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。再封入一新的塑料薄膜袋内。第14页/共23页 加入封闭液后的塑料袋第15页/共23页 一抗反应二抗反应3、与酶标第二抗体结合(1)加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37℃摇床上轻轻摇动50min。(2)取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。第16页/共23页  4、加底物溶液显色 将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。转入水中保存。第17页/共23页 四、结果分析 在凝胶成像分析系统上照相，并分析结果。测量分子量标准蛋白的迁移距离，作出标准曲线，再测出硝酸纤维素膜上的人IgG条带的迁移距离，在标准曲线上查出人IgG重链的分子量。第18页/共23页 凝胶成像分析系统第19页/共23页 四、需配制的试剂1、TBS（Tris-HCl,NaCl）缓冲液：20mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl，pH7.5，每组配200ml。2、TTBS：取100ml TBS，加250μl 20%Tween-20。3、封闭液及抗体稀释液：1％脱脂奶粉-TBS，每组配10ml。4、底物溶液：2.5mg二氨基联苯胺（DAB）+ 10mlTBS + 10μl H2O2，临用前配制。 (由一组同学统一配制)6、脱色液：终浓度：乙醇30%，冰乙酸10%