病原菌的分离培养和纯化.docx

一般植物病理学 试验十七、病原菌的分别培育和纯化 一、目的要求 了解分别与纯化微生物的根本原理及方法。 把握倒平板的方法和组织分别、稀释分别、平板划线分别的根本操作技术。(3)把握在平板、斜面及液体培育基上培育病原菌及观看其培育性状的方法。 二、根本原理植物病原菌的分别培育，是植物病理试验室工作中的根本技能。为了获得某微 生物的纯培育，一般是依据该微生物对养分、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适 宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培育基上，或参加某种抑制剂造成只利于此菌生长， 而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分别方法主要有组织分别法和 稀释分别法两种。最常用的方法是组织分别法，而稀释分别法主要用于病组织上产生大量孢 子的病原真菌的分别。病原细菌的分别方法以划线分别法为最常用，在有些状况下也承受稀 释分别法。为了获得分别菌的纯培育，必需要进展分别菌的纯化，纯化的方法类似于分别工 作中承受的稀释分别法或划线分别法。 三、材料、仪器与用具 材料(依当地状况进展选择，以下材料供参考) (1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。(2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。 玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。(4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。 番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。 黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。 黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。(8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms pv.oryeue)。 (9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。(10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。 培育基 pda 培育基；肉膏蛋白胨培育基；加寄主组织煎汁的培育基等。 仪器与用品 超镜工作台、培育箱、培育皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮 筋套、可调式电炉、铝锅等。0．1％升汞溶液配制：升汞 1e 浓盐酸 2．5ml 蒸馏水 1000ml 。先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别留神。 四、试验操作 (一)病原真菌的分别 组织分别法 依据以下步骤进展： 取灭菌培育皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分别日期、材料和分别人 的姓名。提示：为了保证无菌操作，应留意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净 工作台内，工作中临时去取简洁带来杂菌；保证工作人员自身的干净，工作前用肥皂洗手； 无菌操作前还要用 70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 用无菌操作法向培育皿中参加 25％乳酸 1--2 滴(可削减细菌污染)，然后将溶化而冷至 60c 左右的pda 培育基倒人培育皿中，每皿倒 10--15ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培育基。提示：参加 25％乳酸 1～2 滴，可根本保证平板上不消灭污染细菌苗落。除乳酸外， 在培育基中参加适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／ml)可 以抑制 g+细菌生长；加多黏霉素 b(5．0μg／ml)可以抑制 g—细菌生长；加链霉素(40μg ／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大局部细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前参加外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到 45c 左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时 参加。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。 取真菌叶斑病的颖病叶(或其他分别材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(海边长 3--4mm)病组织数块。提示：选择患病的组织作为分别的材料，可以削减腐生菌混入的时机。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的局部滋生，因此，一般斑点病害应在接近健全组织的局部分别。 将病组织放人 70％酒精中浸 3—5s 后，按无菌操作法将病组织移人 0．1％升汞液中分别外表消毒 0．5、1、2、3、5rain(也可使用其他外表消毒剂)，如植物组织柔嫩，则外表消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。提示：先用 70％的酒精浸 2、3s 是为了消退寄主外表的气泡，削减外表张力，70％的酒精亦用于外表消毒，处理的时间较短(一般数秒至 lmin)。升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s 至30min 不等，一般状况下，需时