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目的基因连接及导入第1页/共51页第2页/共51页二、 目的基因与载体的连接（接）质粒DNA分子同一种 限制酶一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA 连接酶重组DNA分子（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。第3页/共51页 （主要有以下4种连接方式） 1) 粘性末端连接 2） 平头末端连接 3） 人工接头法 4） 同源多聚尾连接法工具酶：基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。第4页/共51页几种重要的工具酶 活性 限制性核酸内切酶 识别特异碱基序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基 形成磷酸二酯键 DNA聚合酶 以DNA为模板合成DNA 逆转录酶 以RNA为模板合成cDNA 碱性磷酸酶 切除5?－末端磷酸T4多聚核苷酸激酶 催化核酸5-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶 催化3-端合成同聚尾第5页/共51页 T4 DNA 连接酶 E. coli DNA 连接酶 DNA连接酶DNA 连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3‘-OH 末端与5’-P末端之间形成磷酸二酯键，使末端连接。催化互补粘性末端和平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低 。只能催化互补粘性末端之间的连接第6页/共51页 （一） 粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。 质粒目的基因用同一种或两种限制性内切酶酶切DNA连接酶本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点重组质粒第7页/共51页（二）平头末端连接有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。产生粘性末端的内切酶质粒产生平末端的内切酶核酸酶S1 目的基因核酸酶S1DNA连接酶 本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！重组质粒第8页/共51页（三） 人工接头法 合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接，构建重组DNA。第9页/共51页用接头连接++接头(linker)目的基因DNA连接酶质粒 用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶 本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！重组质粒第10页/共51页（四）同源多聚尾连接法第11页/共51页尾接法质粒目的基因 内切酶末端转移酶 +dCTP末端转移酶 +dGTPDNA连接酶 本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点重组质粒第12页/共51页基因与载体的平末端连接方法有哪些？(1)T4DNA连接酶法 连接平末端DNA分子的方法有2种，一种是直接用T4DNA连接酶连接，另一种是先用末端核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接。T4DNA连接酶同一般的大肠杆菌DNA连接酶不同。T4DNA连接酶除了能够封闭具有3’-OH和5’-P末端的双链DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高浓度酶的条件下,它还能够连接具有完全配对碱基的平末端DNA分子,但其连接效率比粘性端要低的多。第13页/共51页（2） 同聚物加尾法 5’特意的核酸外切酶处理目的基因及质粒的平末端，移去几个末端核苷酸。运用末端核苷酰转移酶，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3’-OH基因上,它并不需要模板链的存在,它一个一个加上核苷酸,构成由核苷酸组成的尾巴,长度可达100个核苷酸。在载体中加入dTTP和末端核苷酸转移酶，在载体3’－OH末端延伸形成单链PolyT尾巴。将两者混合发生互补连接，缺口用DNA连接酶封闭。第14页/共51页3）用化学合成的衔接物连接 DNA分子用化学合成法合成一段10－12个核苷酸，具有限制酶识别位点的寡核苷酸片段，磷酸化后，通过T4DNA连接酶，将片段分别于载体5’端和目的基因片段5’连接起来。用相应的限制性内切酶处理，产生互补的粘性末端。 4）T-A克隆法： TagDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时，还能不依赖模版在产物3’末端加上两个游离的A。只要载体切口除人工加上的游离T，PCR产物即可于载体连接。第15页/共51页T-A克隆T-vector两条链的5’端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A第16页/共51页1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成