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大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计 大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计 PAGE/NUMPAGES 大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计 大肠杆菌基因组DNA的提取 一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。 1、实验原理 提取DNA的一般过程是将分别好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分别蛋白质，获取的DNA溶液经乙醇积淀使DNA从溶液中析出。 SDS的作用机理是因为其能联合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共 价键遇到损坏，失掉二级构造，进而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为 光谱蛋白酶，其重要特征是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的状况 下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反响系统中，SDS可经过错活蛋白破 坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分别；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完好地分别出来。用酚、酚/氯仿抽提除掉蛋白质，最后用无水乙醇积淀DNA。为获取高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除掉RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核 酸形成复合物，在高盐溶液中（mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到 必定的程度（mol/LNaCl）时，从溶液中积淀，经过离心便可将CTAB核-酸的 复合物与蛋白，多糖物质分开。最后经过乙醇或异丙醇积淀DNA，而CTAB溶于 乙醇或异丙醇而除掉。 2、实验试剂与仪器 1）实验资料：大肠杆菌 2）实验试剂： LB液体培育基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl，CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇 3）实验仪器：恒温摇床、低温离心计、微量移液器、水浴锅 1 3、溶液配制 1）LB液体培育基：细菌培育用胶化蛋白胨10g/L，细菌培育用酵母提 取物5g/L，NaCl10g/L，去离子水。 (搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，×105pa高压下蒸汽灭菌20min.) 2）TE缓冲液： 1MTris溶液（取，加ddH2O至1600ml，加热溶解） 1Mtris-HCl溶液（取1MTris溶液160ml用剖析纯盐酸调至Ph= （需浓盐酸约），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用） TE缓冲液（10mMTris-HCl1MmEDTApH=，1MTris-HClBufferPH= 5ml EDTAPH=1ml向烧杯中加入约400mlddH2O平均混淆;将溶液定容到 500ml后，高温高压灭菌，室温保存） 3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用） 4）CTAB/NaCl溶液：（5%w/v，5gCTAB溶于100mlNaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，而后室温保存） 4、实验方法步骤 1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培育基中，一级培育留宿，以10%的接种量进行二级培育，培育至对数期（4-6h）。 2、取菌液置于离心管中，以5000rpm冷冻离心1min，弃上清液 3、加190ulTE悬浮积淀，并加10ul10%SDS,摇匀直至溶液变黏稠 4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀，37℃保温1小时。 5、加30ul5mol/LNaCl,混匀。 2 6、加30ulCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min 7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1），5000rmp离心10min 8、取上清液，加入300ul氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000rmp离心10min 9、取上清液，加入300ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止10min，积淀DNA，5000rmp离心10min 10、加500ul70%乙醇洗积淀，5000rmp离心10min 11、弃上清液，待酒精挥发尽后加30ulTE溶解 12、溶解于20ulTE中，-20℃保存。 二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。 细菌基因组DNA提取试剂盒： 1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒 DP302-0250次420元 2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒 TaKaRaDV810A50650元 3、Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒 GD2411-01BacterialgDNAkit50次423元 GD2411-02BacterialgDNAkit250次1798元 4、Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒 BSC12S150次400元 BSC12M1100次750元 5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒 D3350-00BacterialDNAkit52