lncRNAENST00000484679促进肝癌索拉菲尼耐药细胞迁移侵袭的机制研究.docxVIP

? ? lncRNAENST00000484679促进肝癌索拉菲尼耐药细胞迁移侵袭的机制研究 ? ? 王清清 张杰 肝癌是最常见的恶性肿瘤，发病率占所有恶性肿瘤的第5位[1]。大多数肝癌患者就诊时已是中晚期，失去了根治性手术切除机会。索拉菲尼是一种多激酶抑制剂，能够促进细胞凋亡、减轻血管生成和抑制肿瘤细胞增殖，是治疗中晚期肝癌的一线靶向药物。但是，临床发现患者长期口服索拉菲尼容易产生耐药，同时耐药后的肝癌细胞具有增强的侵袭及远处转移能力，极大地限制了索拉菲尼的临床疗效。因此，探寻索拉菲尼耐药细胞的迁移和侵袭的机制对提高晚期肝癌患者的生存时间具有重要意义。越来越多的证据表明，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在抗肿瘤药物的耐药性中起着重要作用[2-4]。本研究采用lncRNA芯片微阵列分析肝癌索拉菲尼耐药细胞Huh7SR和亲本细胞Huh7中的lncRNA，筛选差异表达的lncRNA，探讨差异表达的lncRNA对肝癌索拉菲尼耐药细胞迁移、侵袭的影响。 1 材料和方法 1.1 试剂 人肝癌亲本细胞Huh7购自中国科学院上海生命科学院细胞库。DMEM培养液购自美国Hyclone公司；一抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、钙黏蛋白N（N-cadherin）、钙黏蛋白 E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）均购自美国Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）凝胶配制试剂盒、Lipo8000转染试剂均购自上海碧云天科技有限公司；CCK-8试剂购自日本Dojindo公司；FBS购自美国Gibico公司；Transwell小室购自美国Corning公司；lncRNA ENST00000484679引物及其特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）及阴性对照（RNAi negative control，siNC）均由广州锐博生物公司设计合成。 1.2 细胞培养 本课题组前期已成功诱导肝癌索拉菲尼耐药细胞Huh7SR，37℃、5%CO2的培养箱中培养。细胞贴壁生长，取生长状态良好、对数生长期的细胞用于下一步实验操作。 1.3 lncRNA芯片微阵列分析 采用lncRNA芯片微阵列分析肝癌索拉菲尼耐药细胞和亲本细胞中的lncRNA，以差异倍数＞2.0和P＜0.05为筛选条件，筛选出差异表达的lncRNA，并进行荧光定量PCR验证。 1.4 细胞转染 按照每孔10×104个细胞的密度接种于6孔板，当细胞密度达到50%，根据Lipo8000转染试剂说明书进行转染。实验组为ENST00000484679-siRNA组，对照组为siNC组。ENST00000484679-siRNA组加入lncRNA ENST00000484679-siRNA转染，siNC组加入无关序列NC-siRNA转染，加入Lipo8000转染试剂后混匀，室温孵育20 min，6 h后更换新鲜培养基。继续培养72 h后行后续实验。荧光定量PCR验证转染效果。 1.5 各组细胞中lncRNA ENST00000484679、ENST-00000484679 mRNA表达水平检测 采用荧光定量PCR法。按照Trizol试剂说明书提取细胞中总RNA，分光光度计检测RNA的纯度和浓度，根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转合成cDNA，然后以cDNA为模板进行特异性扩增。引物序列如下，lncRNA ENST 00000484679上游引物：5-CCGTGAATATGGACAAGTGGAA-3，下游引物：5-CAAGTACCCACACAATATAGAGCAA-3；ENST00000484679 上 游 引 物 ：5-CTAGGGCTTTCCAGTTAAA-3，下游引物：5-CTCAGGTTTCTAAAGTTAA-3；GAPDH上游引物：5-GAACGGGAAGCTCACTGG-3，下游引物：5-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3。以GAPDH为内参，各组设置3个副孔，2-ΔΔCt法计算靶基因的相对表达量。 1.6 细胞迁移及侵袭能力检测 采用Transwell实验。取对数生长期的细胞，用无血清培养液重悬经过转染的Huh7SR，分为ENST00000484679-siRNA组和siNC组，侵袭实验提前于24孔Transwell小室包被基质胶，上室加入约2×104个细胞（200 μl），下室加入含20%FBS的培养液600 μl。置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h，取出小室，用棉签擦除上层未穿透细胞，甲醇固定细胞