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lncrnamlk7-as1在胶质瘤中表达及其对u251细胞增殖和侵袭的影响 胶原肿瘤是颅内最常见的核电站肿瘤，占颅内肿瘤的50%左右。 1 材料和方法 1.1 瘤组织病理学检测 选择2016～2017年手术切除的脑胶质瘤组织标本45例，2007版WHO分级Ⅰ级8例，Ⅱ级15例，Ⅲ级10例，Ⅳ级12例。另选择其中10例瘤旁正常脑组织作对照。 1.2 mir-33-mic7-as1的转染 U251胶质瘤细胞及人正常星形胶质细胞（normal human astrocyte,NHA），均由我院神经外科研究所捐赠，含有10%胎牛血清的1640培养基进行培养。待细胞密度达70%，将培养基更换为Opti培养基，根据脂质体试剂盒说明书进行转染。将miR-375 mimic、miR-375 inhibitor、荧光素酶报告载体以及si-MLK7-AS1分别与lipofectamine2000混匀20 min后，加到培养基中进行转染。si-MLK7-AS1序列：正义链5′-CACGGAGAAGGTCTGCAGGTTCATTTCTGAGCCAG CGAGACCACCAGCCCGCCAG-3′，反义链5′-TGGACCAAATCTTTAATCCTGTAGATCTCGGTCTG AATTTTAAAATACTTTGGTTACCC-3′。根据转染质粒分成四组：转染miR-375 mimic组、转染si-MLK7-AS1组、同时转染miR-375 inhibitor和si-MLK7-AS1组以及只转染miR-375 inhibitor组。 1.3 pcr循环生成mlk7-as1和mir-33 按照Trizol说明书提取胶质瘤、瘤旁正常脑组织、U251细胞及NHA细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度与纯度。逆转录后进入PCR循环反应。MLK7-AS1上游引物5′-TTACCAGACACAACCAAC CCC-3′，下游引物5′-ATCAGTCAGGCCCATTGGTT T-3′；miR-375上游引物5′-CAGGGTCCGAGGTAT T-3′，下游引物3′-CTGCTTTGTTCGTTCG-5′。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.4 细胞活力检测 将对数生长期U251细胞制为单细胞悬液，取100μl细胞接种于96孔板中，浓度约为每孔2 000个细胞。接种24、48、72 h，每孔添加10μl的CCK8溶液（中国碧云天生物技术有限公司）37℃条件下再培养2 h。测定450 nm波长处吸光度，计算细胞增殖率。 1.5 transwell上室 用24孔板将Transwell小室（美国康宁公司）分为上、下两室。将已被稀释的基质胶铺满Transwell上室置于37℃培养箱中。用无血清培养液将细胞浓度调整为1×10 1.6 细胞活力检测 将U251细胞接种于24孔板，并在每孔中将荧光素酶报告载体与野生型以及突变型MLK7-AS1共转染至细胞中，24 h后共转染miR-375相似物。在转染48 h后收集细胞。按照promega公司双荧光素酶活性检测试剂盒（美国普洛麦格公司）说明书对细胞进行处理，使用单光子检测仪检测荧光素酶活性。荧光素酶活性以萤火虫荧光素酶强度与海肾荧光素酶强度之比来计算。 1.7 统计方法 采用SPSS 21.0软件进行分析；计量资料以 2 结果 2.1 低级别胶质瘤组织? 高级别胶质瘤组织（WHO分级Ⅲ～Ⅳ级）MLK7-AS1表达水平明显高于低级别胶质瘤组织（WHO分级Ⅰ～Ⅱ级；P0.05），而低级别胶质瘤组织MLK7-AS1表达水平又明显高于瘤旁正常脑组织（P0.05）。U251细胞MLK7-AS1表达水平明显高于NHA(P0.05）。见图1。 2.2 mir-33表达水平比较 高级别胶质瘤组织（WHO分级Ⅲ～Ⅳ级）miR-375表达水平明显低于低级别胶质瘤组织（WHO分级Ⅰ～Ⅱ级；P0.01），而低级别胶质瘤组织miR-375表达水平又明显低于瘤旁正常脑组织（P0.05）。U251细胞miR-375表达水平明显低于NHA(P0.05）。见图2。 2.3 u3000各基因型mlk7-as1细胞中mir-33的表达 序列分析发现MLK7-AS1与miR-375之间存在潜在的特异性结合序列（图3A），表明MLK7-AS1与miR-375可能存在相互作用。荧光素酶报告基因实验结果显示，野生型MLK7-AS1组细胞转染miR-375后，荧光素酶活性较对照组明显降低（P0.05；图3B），而突变型MLK7-AS1组细胞转染miR-375后，荧光素酶活性较对照组无明显变化（P0.05；图3B）。这些结果提示MLK7-AS1可以直接结合并调控miR-375表达。另外，沉默MLK7-AS1组细胞miR-375表达水平明显高于对照组（