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ndm-1基因在不动杆菌属菌株中的分布调查 nwd-1（新戴氏金属盐）是一种新的金属酶基因，可以产生-除氨基丙烯酸-其他氨基酸-内酰胺类抗生素。NDM-1基因一般存在于携带多种耐药基因的质粒上, 从而造成菌株表现出多重耐药性。该基因主要在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌中发现, 另外在一些假单胞菌和不动杆菌属菌株中也有报道 供体菌及金属酶基因检测 收集2012年9月~2013年12月南京大学医学院附属鼓楼医院临床分离耐亚胺培南鲍曼不动杆菌25株、洛菲不动杆菌3株和琼氏不动杆菌2株。其中痰液18份、腹水4份、胆汁3份、导管头和尿液各2份、血液1份, 无重复分离株。所有菌株均经API 32GN鉴定条 (法国梅里埃公司) 鉴定。以ATCC Escherichia coli 25922、ATCC Pseudomonas aeruginosa 27853、ATCC Klebsiella pneumoniae 1705、ATCC Klebsiella pneumoniae1706为质控菌株;E.coli 600 (利福平耐药) 为接合试验的受体菌。 Taq DNA聚合酶、10×buffer (含M g 药敏纸片购自英国Oxoid公司, 多粘菌素B及替加环素MTS (MIC Test Strip, 意大利Liofilchem公司) 为辉瑞公司惠赠, 亚胺培南E-Test为梅里埃公司产品。按照CLSI 2014版文件 EDTA纸片协同试验0.5麦氏单位待测菌均匀涂布MH平板, 分别贴两张亚胺培南纸片, 两纸片相距25 mm。在其中1张纸片上滴加500 mmol/L (p H 8.0) EDTA溶液5μl。35℃培养过夜, 亚胺培南+EDTA纸片与单纯亚胺培南纸片的抑菌圈直径之差≥7 mm为金属酶阳性;改良Hodge试验 (MHT) :按照CLSI 2009年版进行, 以ATCC 1705作为阳性对照, ATCC 1706作为阴性对照。 挑取纯培养菌落置0.5 ml离心管内 (内预置200 ng/ml蛋白酶K溶液200μl) , 56℃水浴2 h, 改95℃水浴10 min, 13 000 g离心30 s。上清液即为基因检测的模板液, 置-20℃冰箱备用。 采用P C R法扩增金属酶基因 (MBLs) , 包括IMP、VIM、GIM、SPM、SIM、NDM-1酶基因;O X A型碳青霉烯酶, 包括OXA-2 3-like、OXA-2 4-like、OXA-51-like和OXA-58-like;KPC-2酶基因。参照文献 对数生长期的供体菌及受体菌 (E.coli 600 R) 各0.2 ml加入0.6 ml新鲜LB肉汤中, 37℃过夜培养后, 接种含亚胺培南 (4 mg/L) +利福平 (256 mg/L) 的MH平板筛选接合子。供体菌和受体菌作为质控菌。 将培养过夜的细菌用低熔点胶灌模, 蛋白酶K消化2 h, 限制性内切酶ApaⅠ (30 U) 30℃酶切2 h。使用CHEF-Mapper XA型脉冲电泳仪, 电压6 V/cm, 夹角120o, 脉冲参数5~35 s, 电泳19 h、温度14℃, 分子量标记物为酵母染色体DNA。EB染色30min, 拍照。结果判定参照Tenover标准 非鲍曼不动杆菌耐药基因检测 30株不动杆菌属菌株对12种抗菌药物呈现出多重耐药。K-B纸片法结果显示, 鲍曼不动杆菌对米诺环素、阿米卡星的敏感率分别为3 6%和3 2%, 对其余1 0种抗菌药物耐药率为100%;5株非鲍曼不动杆菌对米诺环素、阿米卡星、复方新诺明敏感, 对其余药物均耐药;所有检测菌株对多粘菌素敏感 (M I C值均≤2μg/ml) , 对亚胺培南全部耐药 (MIC值均≥256μg/ml) ;5株非鲍曼不动杆菌对替加环素全部敏感 (MIC值均≤2 g/ml) ;25株鲍曼不动杆菌对替加环素敏感20株 (80%) , 中介5株 (20%) 。 25株鲍曼不动杆菌的MHT试验阳性1 0株, 而EDTA协同试验均阴性;5株非鲍曼不动杆菌MHT试验均阴性, 而EDTA协同试验均阳性, 提示菌株携带金属酶。 25株鲍曼不动杆菌OXA-23-like和OXA-51-like基因全部阳性, 未扩增出金属酶基因及OXA-24-like、OXA-58-like和KPC-2。5株非鲍曼不动杆菌所测耐药基因中仅NDM-1两对引物扩增结果为阳性, 其余碳青霉烯酶基因均为阴性。NDM-1阳性产物在Gen Bank上比对结果显示与肺炎克雷伯杆菌 (登录号JN677524.1) 、阴沟肠杆菌 (登录号JF798502.1) 和鲍曼不动杆菌 (登录号J F 7 9 8 5 0 1.1) 的N D M-1基因同源性为100%。NDM-1 PCR结果电泳图谱及部分测序结果分别见图1、2