不同地区浓香型大曲质量指标与细菌群落相关性研究.docxVIP

? ? 不同地区浓香型大曲质量指标与细菌群落相关性研究 ? ? 吴 （1.四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000；2.成都海关驻宜宾办事处，四川宜宾644000） “曲乃酒之骨”，大曲是白酒酿造中物系、微生物及酶系的载体，在白酒发酵过程中具有至关重要的糖化发酵生香的作用，其质量与白酒品质息息相关[1]。由于大曲制作过程中受原料、环境的影响较大，使得大曲中微生物情况十分复杂，其中含有大量不同种类的真菌和细菌，尤其是细菌类群极为丰富。 王晓丹等[2]对浓香型大曲中的酶系性能指标和白酒中的微量成分进行了检测，探讨了大曲酶系与白酒品质的关系，总结出大曲糖化力高，而蛋白水解酶、酯化酶活力低，长期使用，白酒质量和产量必然出现下降的趋势。高亦豹等[3]运用PCR-DGGE技术对高温和中温大曲进行细菌的群落结构分析，结果表明Weissella cibaria、L.helveticus、L.fermentum、L.panis 等 乳 酸菌在大曲中普遍存在，而Thermoactinomyces sanguinis仅存在于高温曲中。梁晨等[4]通过高通量测序技术对大曲贮存过程中原核微生物群落结构及风味成分的变化规律进行了研究，结果发现乳杆菌属、芽孢杆菌属、高温放线菌属等是大曲中的优势菌群，且大曲贮存有利于酸、醇、酯的积累且能降低异味物质含量。目前白酒行业还没有制定出相对统一的大曲质量标准，因为不同地区、不同酒企所产大曲的各项指标及其中微生物种类均存在较大差异，因此为了深入了解不同产地浓香型大曲的差异，本试验对四川3个地区的4个不同浓香型酒企所产大曲进行质量指标的测定，并通过高通量测序技术分析其细菌群落结构，并结合质量指标和细菌群落结构进行相关性分析。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 大曲样品分别取自宜宾（最高品温60℃）、泸州（最高品温58℃）和遂宁（最高品温均为55℃），每组样品随机取3个平行样本，一部分置于-20℃冷藏用于大曲基因组的提取，另一部分4℃保存用于大曲质量指标的测定。 氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、可溶性淀粉、L-酪氨酸、干酪素、己酸、无水乙醇、葡萄糖（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；硫酸、盐酸（均为分析纯）：重庆川东化工有限公司；福林试剂：国药集团化学试剂有限公司；饱和酚、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）（均 为 分 析纯）：北京索莱宝科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Trisbase）（分析纯）：美国Sigma-Aldrich公司。 1.2 仪器与设备 Lynx6000型高效落地高速离心机、TSE240VULTS超低温冰箱：美国Thermo公司；ChemiDoc XRS+型水平电泳仪：美国Bio-rad公司；UV-2000型紫外可见分光光度计：上海尤尼柯有限公司；DZKW-4型恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；BS-2F数控恒温摇床培养箱：常州精成国华仪器有限公司。 1.3 试验方法 1.3.1 大曲质量指标的测定方法 大曲水分、酸度、淀粉含量、糖化酶活力、酯化力、液化酶活力、发酵力、酸性蛋白酶活力均Reference[5]中的方法步骤。其中糖化酶活力的定义为1 g绝干曲40℃，pH4.6的环境下反应1 h后，将淀粉水解生成葡萄糖的毫克数，1 mg即1个酶活单位（U/g）。液化酶活力是指1 g绝干曲在60℃、pH 6的环境下反应1 h后，液化可溶性淀粉的克数，1 g即1个酶活单位（U/g）。蛋白酶活力定义为1 g绝干曲在40℃、pH值为3.0条件下1 min水解干酪素产生1 μg酪氨酸所需的蛋白酶量为1个酶活力单位（U/g）。 1.3.2 大曲基因组的提取 将同一大曲的3个平行样本等量混合后进行DNA的提取，本试验采用改良的CTAB[6]法提取大曲中微生物的基因组。 1.4 数据处理 大曲质量指标的试验结果用平均值±标准差表示，使用SPSS 19.0软件中的一般线性模型单因素Duncan法对数据进行方差分析和相关性分析。将高通量测序所得序列与Silva数据库进行比对，获得操作分类单位（operational taxonomic units，OTU）分类。再利用SPSS 19.0软件对大曲质量指标和微生物群落结构进行相关性分析。 2 结果与分析 2.1 不同产地大曲的理化特征 水分、淀粉含量、酸度是衡量大曲质量的重要指标。通常质量等级为一级的大曲水分含量要求低于13%，淀粉含量低于58%，酸度控制在0.9 mmol/10 g～1.3 mmol/10 g之间[1]。本试验通过比较4种不同地区大曲的理化特征，分析其差异，结果见图1。 大曲水分含