蛋白质的分离与纯化.pptVIP

?使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀，方法有： 1. 盐析：在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质从溶液中析出，称为蛋白质的盐析。而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。 盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。 盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。 当前第30页\共有74页\编于星期六\10点 当前第31页\共有74页\编于星期六\10点 2.有机溶剂沉淀法：在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理：破坏蛋白质的水化膜。 有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。 当前第32页\共有74页\编于星期六\10点 3.重金属盐沉淀（条件：pH 稍大于pI为宜）：在蛋白质溶液中加入重金属盐溶液，会使蛋白质沉淀。 重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。 重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。 当前第33页\共有74页\编于星期六\10点 4.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI） 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 “柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”。 当前第34页\共有74页\编于星期六\10点 5.弱酸或弱碱沉淀法：用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。 弱酸或弱碱沉淀法机理：破坏蛋白质表面净电荷。 当前第35页\共有74页\编于星期六\10点 分离纯化蛋白质的一般原则 研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高，不变性； 提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态； 作为药物或食品添加剂：纯度要求一般。 蛋白质分离纯化的一般步骤 材料的选择→原料的预处理→蛋白质的抽提→从抽提液中沉淀蛋白质→纯化→蛋白质的结晶 当前第36页\共有74页\编于星期六\10点 1.原料的选择：要求含待分离的蛋白质丰富，廉价，易得，容易收集，新鲜无腐败。 2.原料的预处理：如果待分离蛋白质为胞外蛋白质，材料破碎后，用适当的溶剂直接抽提；若待分离蛋白质为胞内蛋白质，则需要破碎细胞膜，再用适当的溶剂抽提。 3.从抽提液中沉淀蛋白质：常用盐析法、低温乙醇沉淀法、等电点沉淀法。 当前第37页\共有74页\编于星期六\10点 4. 纯化：将沉淀的蛋白质溶解，再选择适当的纯化方法，得到纯度比较高的蛋白质溶液。 纯化方法：透析或超滤、电泳法、凝胶过滤法、离子交换层析、吸附层析法、超速离心法等。 5. 蛋白质的结晶：从溶液中重新沉淀蛋白质。 当前第38页\共有74页\编于星期六\10点 五 蛋白质分离纯化的方法 （一）据分子量大小不同的方法 1 透析与超滤 当前第39页\共有74页\编于星期六\10点 当前第40页\共有74页\编于星期六\10点 当前第41页\共有74页\编于星期六\10点 当前第42页\共有74页\编于星期六\10点 当前第43页\共有74页\编于星期六\10点 利用压力、抽滤（A）或离心力（B）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。 为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用截向流过滤的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。 滤膜 抽气 滤膜 离心 当前第44页\共有74页\编于星期六\10点 2 密度梯度离心 3 凝胶过滤 以上两种方法既可以用来测定蛋白质的分子量，又可以用来分离蛋白质 当前第45页\共有74页\编于星期六\10点 （二）利用溶解度的差别 1 等电点沉淀 当前第46页\共有74页\编于星期六\10点 2 盐溶与盐析 当前第47页\共有74页\编于星期六\10点 蛋白质溶解度与离子强度的关系 当前第48页\共有74页\编于星期六\10点 无机盐的种类及选择 Ks 取决于盐的性质，与离子价数成正比，与离子半径和溶液介电