保元汤对莲花隐杆线虫的抗衰老作用及机制研究.docxVIP

保元汤对莲花隐杆线虫的抗衰老作用及机制研究 宝元汤最初出现在明代的《爱心经》中。这是治疗情绪虚弱的著名方剂。这组药物包括黄原、人参、甘草和肉桂。它们可以补充很多空气，补充后天的脾脏和肺气，健康的脾脏，保护肺部，温肾，治疗气弱性疾病。因此，包元汤被称为保元汤，并通过历代医家的临床应用来验证其准确性。 1 材料和方法 1.1 长培养基培养菌株 野生型N2秀丽隐杆线虫，采用线虫生长培养基(NGM)，以大肠杆菌Escherichia coli OP50饲喂，由美国宾夕法尼亚大学提供。 1.2 药物和试剂 1.2.1 实验药物 保元汤药物组成:黄芪、人参、甘草、肉桂，比例6∶2∶2∶1(北京同仁堂南京药店有限公司)。 1.2.2 测试试剂 NGM培养基配方:氯化钠(NaCl)3 g，蛋白胨2.5 g，琼脂17 g，磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(K 1.3 高压灭菌锅及生化培养箱 超净工作台(苏净安泰空气技术有限公司);显微镜(日本Olympus公司);高压灭菌锅[致微(厦门)仪器有限公司];生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);离心机、旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司)。 1.4 实验方法 1.4.1 保元汤粗提物的制备 依据保元汤方药物比例称取药材30 g，研成粉末，加10倍量水采用回流提取法提取1 h，提取3次，合并3次药液，旋转蒸发仪蒸发至100 m L，最后采用真空冷冻干燥法获得保元汤粗提物。 1.4.2 秀丽隐杆线虫接种 于空白的NGM培养基中央滴入50μL左右的大肠杆菌菌液，用涂布器将菌液均匀涂布，注意菌液边缘不宜太过，应距离平板边缘5 mm左右，采用团块法将秀丽隐杆线虫接种在含大肠杆菌的NGM培养基上，20°C培养箱中恒温培养 1.4.3 秀丽隐杆线虫线虫裂解观察 用液体NGM冲下培养基中的L4期秀丽隐杆线虫成虫，转至10 m L无菌离心管中，高心机1300×g离心1 min，洗涤2次，保留与约0.25 m LNGM，加无菌水3.75 m L，加碱裂解液[氢氧化钠(NaOH)(5 mol/L) 0.5 m L，漂白剂(Bleach) 1 m L]至混匀振荡，每2 min至于显微镜下观察秀丽隐杆线虫线虫裂解状态，裂解时间不超过6 min。1300×g离心1 min，液体NGM洗涤2次，S-培养基洗涤2次，移除上清，加S-培养基8 m L，置于20℃培养箱中振摇孵育24 h，从而得到生长同期化的秀丽隐杆线虫 1.5 观察指标和方法 1.5.1 观察时间及监测结果 比较各组秀丽隐杆线虫的寿命变化情况，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预，每组100条左右，给药当日年龄标记为0。每日显微镜观察秀丽隐杆线虫的状态，记录存活、死亡数量，计算平均寿命。观测前将96孔板置于摇床上轻轻振摇2 min，秀丽隐杆线虫死亡判定标准为振动或强光刺激秀丽隐杆线虫不弯曲身体或头部不摆动，身体呈僵直状态。 1.5.2 各组不同给药时间 比较各组秀丽隐杆线虫的生殖力变化情况，采用同期化的L1期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L1期后，各组进行给药干预。药物干预48 h后，用移液器吸取秀丽隐杆线虫，转至标注好的1.5 m L离心管中，1300×g离心1 min。移除上清，加线虫M9缓冲液，1300×g离心1 min，重复2次。移液器吸取秀丽隐杆线虫至空白NGM培养皿上，每板1条，每组15条，转移至20℃培养箱中培养24 h，显微镜下观察统计每块培养皿上的虫卵数目。 1.5.3 预给药、给药及药物干预 的运动能力变化情况，正常情况下其以S形向前移动，衰老后运动能力下降，运动弯曲的频率减少，可反映其生命活力，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预。药物干预6 d后，用移液器吸取线虫，转至标注好的1.5 m L离心管中，1300×g离心1 min。移除上清，加线虫M9缓冲液，1300×g离心1 min，重复2次。移液器吸取秀丽隐杆线虫至空白NGM培养皿上，每板5条，每组15条，让其自由运动1 min，显微镜下统计秀丽隐杆线虫1 min内运动S形的个数(即1 min内走过的峰数)，重复3次。 1.5.4 移液加线虫观察 比较各组秀丽隐杆线虫的头部摆动变化情况，头部摆动行为定义为头部摆动方向改变且改变角度大于90°，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预。药物干预6 d后，用移液器吸取线虫，转至标注好的1.5 m L离心管中，1300×g离心1 min。移除上清，加线虫M9缓冲液，1300×g离心1 min，重复2次。移液器吸取秀丽隐杆线虫至空白NGM培养皿上，每板5条，每组