细胞生物学课件第三章细胞技术详解.pptVIP

明 暗 偏 当前第31页\共有88页\编于星期四\21点 二、电子显微镜 （一）透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM 当前第32页\共有88页\编于星期四\21点 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。 1. 原理 当前第33页\共有88页\编于星期四\21点 当前第34页\共有88页\编于星期四\21点 透射电子显微镜 TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM 当前第35页\共有88页\编于星期四\21点 表二、不同光线的波长 当前第36页\共有88页\编于星期四\21点 2、制样技术 1）超薄切片 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 当前第37页\共有88页\编于星期四\21点 当前第38页\共有88页\编于星期四\21点 2）负染技术 用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 Negative Stained Actin 肌动蛋白纤维的 负染电镜照片 当前第39页\共有88页\编于星期四\21点 3）冰冻蚀刻 freeze-etching 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，即为复膜（replica）。 A Yeast Cell 当前第40页\共有88页\编于星期四\21点 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。 （二）扫描电子显微镜 当前第41页\共有88页\编于星期四\21点 Scanning electron microscope（ SEM） 当前第42页\共有88页\编于星期四\21点 工作原理：用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 当前第43页\共有88页\编于星期四\21点 扫描电子显微镜原理 当前第44页\共有88页\编于星期四\21点 当前第45页\共有88页\编于星期四\21点 酵母细胞 当前第46页\共有88页\编于星期四\21点 （三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。 当前第47页\共有88页\编于星期四\21点 扫描隧道显微镜原理 当前第48页\共有88页\编于星期四\21点 当前第49页\共有88页\编于星期四\21点 STM image, Benzene molecules accumulate at step edges on Cu 当前第50页\共有88页\编于星期四\21点 三、显微操作技术micromanipulation technique 在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史，Gurdon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获