紫外光对绿僵菌对大肠杆菌的敏感性.docxVIP

紫外光对绿僵菌对大肠杆菌的敏感性 金龟子绿僵硬菌（重金属riza）对各种害虫有杀菌效果。 1 材料和方法 1.1 蛋白基的配制 1.1.1供试药剂体积分数98%多菌灵。 1.1.2培养基PPDA培养基由PDA培养基加入质量分数2%的蛋白胨配制而成。 1.1.3供试菌株金龟子绿僵菌MA2,MA3,MA4,MA8和MA9等5个对椰心叶甲具高致病力菌株(另文报道)，由本实验室从椰心叶甲僵虫中分离、筛选和保存。 1.2 微生物菌株的培养 1.2.1供试药剂母液的配制及含药培养基的制备99%多菌灵用0.1 mol/L的盐酸溶解，然后加入无菌水配成10 000μg/mL的母液。然后按试验所需的药剂处理浓度，吸取相应体积的母液分别加入灭菌的PPDA培养基中，混合均匀后倒入培养皿中制成含药培养基平板。 1.2.2供试菌株对多菌灵的敏感性测定把供试菌株置于PPDA培养基中活化培养7 d，挑取分生孢子置于含有无菌水（含质量分数0.1%吐温80）的2 mL灭菌离心管中，于涡旋仪中剧烈振荡30 s，不断以无菌水或绿僵菌孢子进行调节，使分生孢子的最终浓度为1×10 1.2.3紫外光诱导抗药性取100μL已制备好的绿僵菌不同菌株的分生孢子悬浮液，分别均匀涂于含多菌灵200μg/mL的PPDA培养基中，然后置于30 W的紫外灯下20 cm处，分别照射5,10,15 min，每菌株和每个处理时间各3皿，置于(26+2)℃的培养箱中培养，对照不经紫外光照射外，其它条件相同。7 d后观察各菌株的生长情况。 1.2.4抗性菌株对多菌灵的敏感性测定选取在多菌灵200μg/mL的PPDA培养基中生长速率较快的菌落3个，分别进行单孢纯化培养，获得抗性菌株3个，分别记为MUV1,MUV2,MUV3。然后以1.2.2的方法把供试菌株置于含多菌灵0(CK),50,100,300,500,600μg/mL的PPDA平板上，其它条件相同，3 d后开始测量菌落直径。分别计算EC 1.2.5抗性菌株MUV1、MUV2和MUV3在紫外光中的稳定性测定取各菌株分生孢子悬浮液100μL分别涂于含多菌灵5μg/mL的PPDA培养基中，然后置于30 W的紫外灯下20 cm处，分别照射5,10,15,20 min，每菌株和每个处理时间各3皿。对照不经紫外光照射外，每菌株的分生孢子悬浮液分别涂于含多菌灵5和300μg/mL的PPDA培养基中，（26±2）℃下培养。7 d后观察各菌株的生长情况，并再重复以上试验2次。 2 结果与分析 2.1 绿色硬菌ma2、ma3、ma4、ma8和ma9对细菌的敏感性 结果表明，所有供试的野生型菌株在含多菌灵5μg/mL的PPDA培养基中已不能生长，其EC 2.2 菌落数量及体外菌落数量对供试菌株的影响 各菌株经紫外光诱变后，在200μg/mL的PPDA培养基中均长出了不同数量的菌落，而在不经紫外光照射的对照中，所有的供试菌株均无菌落出现。在不同的紫外光处理时间中，照射时间为10 min时，诱变效果较好，突变率2×10 2.3 抗感菌对细菌的敏感性测试 抗性菌株对多菌灵的敏感性测定结果表明（表2），各供试抗性菌株的EC 2.4 对培养基生长的影响 各抗性菌株经紫外光再次照射5～20 min后，在多菌灵5μg/mL的PPDA培养基中基本不能生长，在5和20 min的处理中只有零星的菌落出现。而不经再次照射的对照却均能在5和300μg/mL条件下正常生长。该试验再重复2次的结果一致。说明由紫外光诱变的抗性菌株，经再次的紫外光照射后易发生回复突变（见图1）。 3 对绿匹菌进行抗药性改良 在自然条件下，绿僵菌对多菌灵是敏感的，在多菌灵5μg/mL下已完全不能生长，一般情况下，多菌灵在田间的使用浓度为500～1 000μg/m L，因此在有多菌灵的环境中，绿僵菌将会受到显著抑制，绿僵菌也难以发挥其应有的生防潜力，因此，田间应用时应避免与杀菌剂同时使用，同时也表明了对绿僵菌进行抗药性改良是提高绿僵菌抗性的主要研究方向之一。 本试验通过紫外光诱变获得了对多菌灵的抗性菌株，在多菌灵600μg/mL或更高的条件下均可缓慢生长，其抗性可提高120倍以上，但这些突变体在紫外光的再次照射后抗性很不稳定，易发生回复突变。因此，若把这些抗性菌株在田间进行生物防治时，由于太阳紫外线的照射，也可能表现出同样的不稳定性。因此，用紫外光诱变获得的抗药性菌株不适用于田间的推广应用。 一般情况下，真菌对多菌灵产生的抗性突变发生于β-微管蛋白序列，在紫外光的诱导下，使该序列部分碱基发生突变，导致编码氨基酸发生改变，最终使β-微管蛋白的构型发生了突变，使之降低了与多菌灵的亲和力，形成了抗药性 本试验的结果证实了因回复突变因素，用紫外光对绿僵菌进行诱导以获得抗药突变体的方法并不理想。探求筛选自然抗药突变体、以