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37和73磷灰石双相骨修复材料的ames试验研究 骨修复材料是一种新型生物材料，是目前生物材料研究的热点。骨修复材料分为医用金属材料、医用生物陶瓷、医用高分子材料和医用复合材料, 可广泛用于人工骨、人工关节、人工齿根、骨结合材料等许多方面。研究开发新型骨修复材料以满足医学科学发展和临床需求逐步成为研究重点 磷酸三钙 (Tricalcium Phosphate, TCP) 和羟基磷灰石 (hydroxyapatite, HA) 都是最常使用的骨修复材料, 均为生物活性陶瓷。磷酸三钙的分子式为Ca 双相骨修复材料在临床应用前首先要依据GB/T16886系列标准进行生物安全性评价, 其中的遗传毒性评价不可或缺。一直以来, 学者们都会使用鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 (Ames试验) 对材料的致突变性进行初步研究, 如纳米羟基磷灰石人工骨, 纳米磷酸三钙复合人工骨、聚-羟基丁酸酯材料等 本研究采用生理盐水和二甲基亚砜两种浸提介质进行试验, 通过Ames试验来检测-TCP/HA双相骨修复材料的致突变性, 对体外遗传毒性的潜在风险进行评估, 为医疗器械产品的选材和风险评估提供毒理学数据, 为人体使用的安全性奠定基础。 1 材料和方法 1.1 试验材料和提取物的制备 1.1.1 双相材料相型材料 试验选用磷酸三钙/羟基磷灰石 (-TCP/HA) 双相材料, -TCP与HA比例分别约为3∶7和7∶3。材料为白色粉末, 洁晶度≥50%, 粒径在0.3~0.5mm;其Ca/P原子比1.5±0.5。 1.1.2 浸提介质成分配介质 采用0.9%氯化钠溶液 (SC) 和二甲基亚砜 (DMSO) 两种溶剂作为浸提介质。按0.2g/ml的浸提比例, 分别加入SC和DMSO进行浸提, (50±2) ℃放置72小时, 备用。 1.1.3 敌克松sc/sco 阴性对照:取上述同批号SC和DMSO, 置相同条件下浸提72小时。 阳性对照:非活化试验 (-S9) , 使用0.5mg/m L敌克松 (Dexon) , 用SC配制;活化试验 (+S9) , 菌株TA97、TA98、TA100使用2mg/m L的2-氨基芴 (2-AF) , 菌株TA102使用0.5mg/m L的1, 8-二羟基蒽醌, 均用DMSO配制。 1.2 菌株鉴定情况 采用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株TA97、TA98、TA100和TA102四株菌, 均经组氨酸缺陷型鉴定、脂多糖屏障缺陷鉴定、R因子鉴定、uvr B修复缺陷型鉴定、四环素抗性鉴定和自发回变率鉴定合格。 1.3 生化活性试验 制备添加了VB液和葡萄糖溶液的琼脂培养基平板, 备用。顶层培养基分装成2m L/管, 灭菌后备用。采用由大鼠肝制备的S9混合液提供代谢活化环境。非活化试验中, 在保温的顶层培养基中依次加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液0.5 m L、样品浸提液0.1 m L和新鲜菌液0.1 m L, 混匀后倾入底层培养基上, 阴性对照组加入0.1m LSC, 阳性对照加入0.1m LDexon。活化试验中, 加入5%的S9混合液替代磷酸盐缓冲液同法试验, 阳性对照加入0.1 m L 2-AF或1, 8二羟基蒽醌。每组均设3个平行皿。方法详见文献 2 结果 2.1 回复突变菌落数ue0afs的测定 计数并记录每一平皿的回变菌落数, 计算出3个平行皿的平均值, 以平均数±标准差 (ue0af±s) 表示。阴性对照组回复突变菌落数应在预期的范围内, 阳性对照组回变菌落数应至少为预期范围的3倍。在背景菌生长良好的条件下, 检测样品浸提液各浓度组变异频率比阴性对照至少增加2倍, 即为阳性反应 2.2 sc浸提液组 平板培养48~72小时后, S9混合液检菌平皿无菌落生长;以SC为浸提介质对-TCP/HA为3∶7和7∶3的双相材料进行浸提, TA97、TA98、TA100及TA102菌株回复突变的计数结果见表1。 2.3 独立dmso提取物组 以DMSO为浸提介质对两种双相材料进行浸提, TA97、TA98、TA100及TA102菌株回复突变的计数结果见表2。 2.4 样品的致突变性试验 表3列出了各菌株回复突变菌落的致突变比值结果, 依据试验菌株的致突变比值 (致突变比值MR=实验组回变菌落数/阴性对照组回变菌落数) 判断样品是否具有致突变性。 结果显示, 在该试验条件下, 阴性对照组和阳性对照组结果均有效, 试验成立。无论以SC浸提还是以DMSO浸提, 活化和非活化条件下, 两种不同比例的样品浸提液对TA97、TA98、TA100和TA102菌株的回变菌落数均未大于阴性对照组2倍 (即MR2) 。 3 遗传毒性评价 理想的骨修复材料要有良好的生物相容性、良好的生物降解性、具有三维立体多孔结构、具有一定机械强度和骨引导性等 研究发现