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束花石斛及其相似种rdnais序列比较研究
石斛植物是兰科附生植物的重要代表,许多品种具有重要的药用价值。因此,国内外科学家对其形态特征、分类、化学成分、药理活性、工艺繁殖等方面进行了多方面的报道。
近年来, 特定的DNA序列不断被用于中药材的鉴定研究
实验材料及材料
实验所用的束花石斛及其相似种的原植物采自我国石斛主产区:云南、广西、贵州等省区的原始森林, 现被整丛栽种于中国药科大学药用植物园及实验室以便及时取材和观察, 有关实验材料的详细情况请参见表1, 每种植物均测试了来源于不同居群的2~3个个体, 各标本由中国科学院植物研究所吉占和教授以及丁小余鉴定, 保存于中国药科大学的标本馆中。
序列测定的结果
用改性材料研成粉末
取各样品新鲜原植物或药材的叶片或茎0.1 g, 也可采用硅胶干燥材料, 用无菌水冲洗干净, 在液氮中研成粉末。根据QIAGEN试剂盒的使用指南进行总DNA提取。
pcr扩增
根据Emmanuel等
pcr产物的纯度
PCR产物用Wizard或Watson试剂盒纯化, 按试剂盒操作指南进行。
序列测量
用BigDye
序列数据分析
ITS1和ITS2的起止范围参照Genbank中兰科ITS范围, 所得DNA序列输入计算机后, 用ClustalX软件
植物种的关系
运用MEGA软件对5种植物rDNA ITS序列进行了排序, 结果如图1 (18S, 26S片段已删除, 5.8S为阴影部分所示, “.”部位表示具相同碱基) 。本文5种植物的rDNA ITS序列已被收录于Genbank中, 详情请见表1。由于所测试的各种石斛不存在种内差别, 故本文不列出相同序列。
束花石斛及其相似种rDNA ITS区具有鉴别意义的碱基位点如方框所示, 其中ITS1区域有5个位点, 5.8S区3个位点, ITS2区域有6个 (图1) 。在这些位点上, 虽然4个相似种的碱基均相同, 但与束花石斛均不同, 其位置及碱基变换情况列表2。束花石斛及其相似种rDNA ITS区的碱基替换数以及遗传距离见表3。
束花石斛与相似种轮值比较
近几年来, 生物体内被称为“活化石”的rDNA, 因具比cpDNA更快的进化速率, 且不存在cpDNA的母系单向遗传, 被用作研究科内、属内、种间的分子系统演化及物种鉴别的重要分子标记
本文通过对束花石斛及其相似种rDNA ITS区全序列的比较研究, 发现束花石斛与其相似种间存在较大的、稳定的差异, 碱基替换总数高达75~80, 遗传距离为12.14%~12.64%, 在本试验中尚未发现种内居群间的差异。在束花石斛与其相似种rDNA ITS区的全序列内, 经过MEGA分析软件的对位排列, 我们共挑选出15个具有鉴别意义的碱基位点, 其中ITS1区域有6个位点, ITS2区域有6个, 另外在5.8S保守区还有3个位点。在这15个位点上, 虽然4个相似种每个的碱基均相同, 但与束花石斛均不同, 因此它们的rDNA ITS区序列特征是鉴别束花石斛及其相似种极好的分子标记。利用特定DNA 序列鉴定原植物及中药材, 可完全消除鉴别性PCR中存在的假阳性现象, 既准确又可靠。随着测序成本的日益降低, 此方法将逐渐变得切实可行。
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