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l-丝氨酸野生型谷氨酸棒杆菌syps-1062的基因克隆与分析 l-氨基丙烯酸是一种非必要的氨基酸，广泛应用于医药、食品、护理等领域。年用量约为3000吨。 目前国内外对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的研究集中在其合成和降解途径的分子改造, STOLZ等以不产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株, 构建的重组菌以葡萄糖和果糖为混合碳源时L-丝氨酸产量36.2 g/L 本课题组前期从自然界中筛选得到1株能利用糖质原料发酵产L-丝氨酸的野生型谷氨酸棒杆菌SYPS-062, 以它为出发菌株通过多轮化学诱变获得突变株SYPS-062-33a 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 保藏及保藏 产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌ΔSSAAI为研究室前期构建并保藏;大肠杆菌JM109为实验室保藏;谷氨酸棒杆菌敲除质粒p K18mobsac B为实验室保藏 1.1.2 工具酶的来源 涉及DNA相关操作分子试剂盒均购于上海捷瑞公司;分子操作涉及到的工具酶均购于Ta KaRa;蔗糖、磷酸二氢钠、琼脂粉等配制培养基的试剂均购于国药试剂有限公司;脑心浸液 (BHI) 、原儿茶酸、生物素等购于sigma公司;硫酸卡那霉素购于上海生物工程有限公司。 1.1.3 培养基g/l (1) LB培养基 (g/L) :蛋白胨10, 酵母粉5, 氯化钠10 (固体培养基, 琼脂粉20) ;121℃灭菌20 min; (2) 种子培养基 (g/L) :脑心浸液37, 葡萄糖20, (NH (3) 发酵培养基 (g/L) :蔗糖100, Ca CO (4) 谷氨酸棒杆菌感受态培养基 (g/L) :蛋白胨10, 酵母粉5, 氯化钠10, Tween-80 1, 甘氨酸25;121℃灭菌20 min; (5) 谷氨酸棒杆菌电转化培养基 (g/L) :蛋白胨5, 酵母粉2.5, 氯化钠5, 脑心浸液18.5, 山梨醇91;121℃灭菌20 min; (6) 10%蔗糖筛选培养基 (g/L) :脑心浸液37;蔗糖100; (NH 1.2 方法 1.2.1 全源臂的检测 敲除质粒的构建:以敲除基因SD36_RS01255为例, 将谷氨酸棒杆菌ΔSSAAI基因组作为模板, 利用引物1255-1/2, 1255-3/4分别扩增基因SD36_RS01255上下游同源臂片段, 然后以扩增得到的同源臂为模板利用引物1255-1/4进行二轮扩增, 得到目的基因截短的同源臂。将得到的同源臂和敲除质粒p K18mobsac B用限制性内切酶EcoRI、Xba I双酶切, 利用T4 DNA ligase连接, 得到重组敲除质粒。 回复突变的重组质粒的构建:基因回复突变是利用质粒p K18mobsac B实现。以SYPS-062的基因组为模板, 利用引物1255M-F/R扩增目的基因, 目的基因和敲除质粒p K18mobsac B用限制性内切酶EcoRI、Xba I双酶切, 利用T4 DNA ligase连接, 得到回复突变的重组质粒。 过表达质粒的构建:以谷氨酸棒杆菌ΔSSAAI基因组为模板, 利用引物1255-for/rev扩增基因SD36_RS01255, 将目的基因片段和质粒p DXW-10用限制性内切酶EcoRI、pst I双酶切, 利用T4 DNA ligase连接, 得到重组质粒。 1.2.2 阳性转化子的筛选、pcr和测序 敲除与回复突变重组菌的构建:制备ΔSSAAI电转化感受态细胞, 将相应的重组质粒电转入ΔSSAAI感受态细胞, 电转化条件1.8 k V、5 ms, 在谷氨酸棒杆菌电转化培养基中加入适量的硫酸卡那霉素 (50mg/m L) 筛选阳性转化子, 阳性转化子在10%蔗糖培养基进行二次筛选, 得到的转化子进行PCR扩增或者测序验证。 过表达重组菌的构建:制备ΔSSAAI电转化感受态细胞, 将重组过表达质粒电转入ΔSSAAI感受态细胞, 电转化条件1.8 k V、5 ms, 在谷氨酸棒杆菌电转化培养基中加入适量的硫酸卡那霉素 (50 mg/m L) 筛选阳性转化子, 最终提取质粒, 通过PCR及双酶切验证, 得到过表达重组菌。 1.2.3 odl-丝氨酸和糖浓度的检测 生物量的测定:发酵液用1 mol/L HCl稀释至一定浓度, 紫外分光光度计检测OD L-丝氨酸和糖浓度的测定:采用HPLC测定发酵液中糖及L-丝氨酸产量 2 结果与分析 2.1 通过分析差异异质因子，以及基因切除菌株的构建 2.1.1 突变株与丙酮酸脱氢酶基a-氨酸积累量的关系 SYPS-062-33a与SYPS-062比较基因组学研究结果表明, 有12个基因发生了非同义突变, 对其中5个突变的基因做回复突变或者敲除的研究, 发现其中丙酮酸脱氢酶亚基ace E点突变与突变株SYPS-