DB34T 2071-2014杂交玉米及亲本真实性鉴定DNA分析方法.docxVIP

ICS 67.060 B 22 安 徽 省 地 DB34 方 标 准 DB 34/T 2071—2014 杂交玉米及亲本真实性鉴定 DNA 分析方法 Identification of genuineness of hybrid corn and its parents using DNA analysis method 2014 - 02 - 17 发布 2014 - 03 - 17 实施 安徽 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 I DB34/T 2071—2014 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省质量技术监督局提出， 安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省农业科学院水稻研究所。 本标准主要起草人： 陆徐忠、杨剑波、倪金龙、刘勋辉、李莉、汪秀峰、马卉、张小娟。 1 DB34/T 2071—2014 杂交玉米及亲本真实性鉴定 DNA 分析方法 1 范围 本标准规定了杂交玉米及亲本品种真实性鉴定SSR分子标记法的术语和定义、原理、试剂与溶液、 主要仪器、操作步骤和结果判定。 本标准适用于玉米单交种和自交系的品种真实性鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 GB 4404.1 粮食作物种子 第1部分:禾谷类 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种真实性 varietal genuineness 供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。本标准中指品种间在 DNA 分子标记带型上的一致性。 3.2 标准样品 standard sample 经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，对有性繁殖作物而言，一般为种子。 4 原理 根据 SSR 序列两端保守的单拷贝序列设计特异引物， 利用 PCR 技术扩增每个位点的重复次数，通 过电泳分析其长度多态性，进行杂交玉米及亲本的真实性鉴定。 5 试剂与溶液 5.1 仅使用分析纯试剂和符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.2 β-巯基乙醇 2 DB34/T 2071—2014 5.3 异丙醇 5.4 剥离硅烷 5.5 四甲基乙二胺(TEMED) 5.6 Taq DNA 聚合酶 5.7 PCR 反应缓冲液(10×Buffer) 5.8 25 mmol/L 氯化镁溶液(MgCl2) 5.9 DNA 分析仪专用丙烯酰胺胶液 5.10 DNA 分析仪专用分子量内标 5.11 DNA 分析仪专用电泳缓冲液 5.12 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(Tris-Hcl) ：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 溶解于 800 mL 水中， 用盐酸(HCl)调 pH 至 8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa(121 ℃)条 件下灭菌 20 min，4 ℃储存。 5.13 10 mol/L 氢氧化钠溶液(NaOH)：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠(NaOH)， 溶解后， 冷 却至室温， 再加水定容到 200 mL。 5.14 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液：2 g 固体氢氧化钠溶于 450 mL 水中，加水定容至 500 mL。 5.15 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(EDTA-Na2) (pH 8.0)：称取 187.6 g 乙二铵四乙酸二钠 (EDTA-Na2)加入 800 mL 水中，再加入适量氢氧化钠溶液，加热至完全溶解后， 冷却至室温，用氢氧 化钠溶液调 pH 值至 8.0， 加水定容至 1000 mL。在 103.4 kPa(121 ℃) 条件下灭菌 20 min， 4 ℃储存。 5.16 十六烷基三甲基溴化铵提取液(CTAB) ：81.7 g 氯化钠和 20 g 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 溶于 800 mL 水中， 然后加入 1 mol/L Tris-HCl 100 mL，0.5 mol/L EDTA-Na2 40 mL， 定容至 1000 mL， 4 ℃贮存。 5.17 TE 缓冲液 1：1 mol/l 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液 5 mL，0.5 mol/l EDTA-Na2 1 mL，加 HCl 调 pH 至 2.0，加水定容至 500 mL。 5.18 TE 缓冲液 2：1 mol/l 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液