核酸扩增技术(下)V.pptVIP

Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force 平行变性梯度凝胶电泳DGGE p53 基因8 号外显子的野生型和突变型等位基因在平行梯度（40–65% 变性剂） DGGE凝胶上。左道，突变型等位基因；中，野生型等位基因；右，突变型与野生型等位基因。 （二）凝胶的变性梯度方向与电泳方向平行： 当前第63页\共有84页\编于星期三\6点 Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force 五、熔点曲线－ SYBR Green I 染料法 将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT) 原始图谱 对数图谱 PCR产物中点突变的分析 当前第64页\共有84页\编于星期三\6点 Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force 熔点曲线－－ SYBR Green I 染料法 熔点曲线分析，单一峰无非特异性荧光： 单一特异产物 熔点曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光： 多个不同产物 当前第65页\共有84页\编于星期三\6点 Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force “双脱氧－ddNTP”　　 六、PCR产物测序分析（直接或克隆后测序） 　　 正常 PCR产物中点突变的分析 当前第66页\共有84页\编于星期三\6点 Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force 小结：PCR产物的检测与分析 （一）PCR有效性和正确性 琼脂糖凝胶电泳法 （二）PCR产物的定量和序列分析 琼脂糖凝胶电泳法、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR产物中点突变的分析： PCR-RFLP, ASO, SSCP, DGGE, 熔点曲线分析，测序分析 当前第67页\共有84页\编于星期三\6点 Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force 第五节 临床基因扩增检验的质量管理 当前第68页\共有84页\编于星期三\6点 Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force PCR的特点及应用 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 当前第69页\共有84页\编于星期三\6点 Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force 一、临床PCR实验诊断的基本要求 1．应该建立实验制度，其中包括《标本采集、接收、存放及处理制度》、《临床基因诊断实验室作制度》、《消毒及防止污染制度》。 2．每个基因检测项目均建立操作及质量控制手册。 3．建立各级人员的工作职责；设立专业技术主管。 4．PCR实验室必备的条件不得缺少，否则不能开展临床基因实验诊断工作。 5．临床基因诊断实验室禁止无关人员出人，实验室主要通道出入口及各功能区域门口，应有“禁止入内”和“生物污染”等字样及标志。 当前第70页\共有84页\编于星期三\6点 Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force 二.PCR操作程序标准化 （一）上岗人员培训制度 （二）标准化PCR诊断实验室 （三）PCR标准化操作程序 1．试剂配制、分装及保存 2．标本的采集与处理 3．基因扩增及其实验条件的选择 4．扩增产物检测 5．PCR结果的判读 （四）污染的预防及污染源的标准化处理 当前第71页\共有84页\编于星期三\6点 Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force PCR实验中污染的预防 ①严格执行各项规章制度，按规程进行实验操作； ②实验时，必须戴一次性手套（处理标本时需戴乳胶手套），并随时更换； ③工作