SN_T 2708-2010猪圆环病毒病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2708—2010猪圆环病毒病检疫技术规范Quarantine protocol for porcine circovirus disease2011-05-01实施2010-11-01发布中华人民共和国发布0国家质量监督检验检疫总局数码防你 SN/T 2708--2010言前本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、广东省农业科学院兽医研究所。本标准主要起草人：朱道中、刘中勇、刘俊平、宋长绪、蒋智勇、陶琦、陈茹、林志雄。 SN/T 2708-2010猪圆环病毒病检疫技术规范1 范围本标准规定了猪圆环病毒病的病毒分离、鉴定和疫病诊断等方法的技术要求。本标准适用于猪圆环病毒病的监测、检疫、诊断和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阀值时所经历的循环数CPE:细胞病变效应DNA:脱氧核糖核酸FITC:异硫氰酸荧光黄IFA：间接免疫荧光试验MEM:最低要求培养基Marker：分子量标记物nPCR：巢式聚合酶链式反应PCV1:猪圆环病毒 1 型PCV2:猪圆环病毒 2 型PK-15:猪肾传代细胞系PBS:磷酸盐缓冲液Real-time PCR:荧光聚合酶链式反应SDS:十二烷基磺酸钠Taq 酶:Taq DNA 聚合酶4检疫方法4.1 病毒的分离与鉴定4.1.1器材48孔或96孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、0.2μm的微孔滤膜、普通光学显微镜。1 SN/T 2708-20104.1.2试剂MEM培养液、胎牛血清、D-氨基葡萄糖、青霉素(104 IU/mL)和链霉素(104 μg/mL)溶液。4.1.3PCV2 易感细胞PK-15 细胞。4.1.4 PBS见附录 A。4.1.5病料采集无菌采集病死猪的腹股沟淋巴结、脾、肺、肾等组织样品或病猪的抗凝血，4℃保存，立即送检。若不能立即送检，应置一20℃以下条件保存备检。4.1.6 病毒分离将采集的组织样品用PBS按1：10的比例进行稀释，研磨成匀浆，或取病猪的抗凝血，反复冻融3次后，4500g离心15min,取上清液；经微孔滤膜过滤除菌接种在无-PCV感染的正常PK-15细胞单层上，感作1h，倾尽接种液，加人含2%胎牛血清的:MEM培养液（含100|IU/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素），37℃继续培养24h,弃清液，加人300mmol/I.的D-氨基葡萄糖0.5mL，作用30min，倾去,PBS洗涤，再加人含2%胎牛血清的MEM培养液（含100IU/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素）,继续培养 24 h～48 h。4. 1.7 病毒鉴定PCV2感染PK-15细胞后不产生明显的细胞病变效应，故需采用IFA（见4.2)或nPCR（见4.3）等方法做进一步的鉴定。4.2间接免疫荧光试验(IFA)4.2.1器材IFA诊断板、荧光显微镜、恒温箱保湿盒、微量移液器等！4.2.2 试剂PCV2单克隆抗体、FITC结合物、0.25%胰蛋白酶、丙酮。4.2.3操作方法吸取 50 μL接种过待检样品、经 0.25%胰蛋白酶消化的 PK-15细胞,加人 IFA诊断板中，置超净工作台中风干，然后加100μL丙酮（一20℃预冷）固定10min，同时设正常PK-15细胞孔和感染了PCV2 的 PK-15 细胞孔作为阴、阳性对照。用 PBS(100 μL/孔)清洗 IFA诊断板 3次,每次 3 min,最后弃去 PBS,在吸水纸上轻轻拍干。滴加工作浓度(PBS稀释1000倍)的鼠源PCV2单克隆抗体100μL，置于湿盒内，37℃感作1h。PBS清洗 IFA诊断板 3次,方法同 。加入工作浓度（PBS稀释50倍)的兔抗鼠FITC结合物，100μL/孔，置于湿盒内，37℃感作30 min~45 min.9 SN/T 2708--20弃去板中液体,PBS清洗4次，方法同。4.2.4荧光显微镜检查在放大100×～400×条件下镜检，荧光显微镜采用蓝紫光（波长：405nm～490nm）。4.2.5结果判定与解释标准阳性细胞孔：细胞边界清晰，胞浆内应出现典型的特异性亮绿色荧光。标准阴性细胞孔：细胞边界清晰，细胞胞浆内不应出现特异性亮绿色荧光。在阴阳性对照孔检测结果成立的条件下,待检样品细胞孔的细胞胞浆