SN_T 1166-2010水泡性口炎检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1166-2010代替 SN/T 1166.1—2002,SN/T 1166.2—2002,SN/T 1166.3-2006水泡性口炎检疫技术规范Quarantine protocol for vesicular stomatitis2011-05-01 实施2010-11-01 发布中华人民共·和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1166--2010前本标准按照GB/T 1.1一2009·给出的规则起草，本标准代替SN/T1166.1—2002《水泡性口炎补体结合试验操作规程》、SN/T1166.2-2002《水泡性口炎微量血清中和试验操作规程》和 SN/T 1166.3-—2006《水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程》。本标准与SN/T 1166.1-2002、SN/T 1166.2—2002和 SN/T1166.3—2006相比，主要技术变化如下：增加了水泡性口炎的病毒分离及鉴定；一增加了荧光反转录聚合酶链反应；增加了竞争酶联免疫吸附试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：花群义、阮周曦、杨俊兴、杨云庆、秦智锋、吕建强、曾少灵、林庆燕、宗卉、张彩虹、周晓黎、董俊：本标准所代替标准的历次版本发布情况为：—SN/T 1166.1—2002;-SN/T 1166. 2--2002;-SN/T 1166.3-2006. SN/T 1166--2010水泡性口炎检疫技术规范范围本标准规定了动物水泡性口炎的病毒分离及鉴定、反转录聚合酶链反应、荧光反转录聚合酶链反应、中和试验、竞争酶联免疫吸附试验的技术要求。本标准适用于动物水泡性口炎的检验检疫。规范性引用文件2下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是在日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文斤有的修改单)适用于本文件。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所）GB/T18088出人境动物检疫采样3缩略语以下缩略语适用于本文件。BHK-21:仓鼠肾细胞BLP:乳糖蛋白陈缓冲肉汤CPE:致细胞病变作用到设定的阐值时所经历的循环Ct 值：每个反应管内的荧光信号c-ELISA:竞争酶联免疫吸附试验,DEPC:焦碳酸二乙酯McAb：单克隆抗体OD值：光密度值PI:抑制百分比TCIDso:半数组织培养感染量Vero:非洲绿猴肾细胞VSV:水泡性口炎病毒VSV-IND:水泡性口炎病毒印地安那型VSV-NJ:水泡性口炎病毒新泽西型！4病毒分离与鉴定4.1 病毒分离4.1.1样品的采集：按GB/T18088进行。主要采集动物口、蹄冠上或乳头上的水泡上皮组织。采集后立即冷藏送检或置碳酸缓冲甘油(配方见附录 A)中低温保藏。采集到的水泡液置灭菌瓶中，冷藏送检或低温保藏。若从冻肉中采样，可采淋,巴结或组织;采集的精液样品应不少于1 mL,冻精样品每头每批次取样 3管～5 管；无症状或无水泡的活动物采集抗凝全血，胚胎及其冲洗液。4.1.2样品的处理：将采集到的止皮、淋巴结或组织样品，经研磨后用0.01.mol/LpH7.2的 PBS(配 SN/T 1166--2010制见附录 A)配制成20%的悬液。精液用乳糖蛋白陈缓冲肉汤(BLP,配制见附录 A)作1：5稀释后，经8.000r/min 4℃离心30min,弃上清液,并弃去浮游脂肪,再用 BLP作1：5稀释成悬液;水泡液、胚胎冲洗液无需处理，全血用BLP作:1：5稀释后，直接用于病毒的分离或鉴定。：4.1.3接种细胞：澄清组织悬液或水泡液与抗生素（含青霉素 2000 IU/mL、链霉素 2000 μg/mL)4℃作用30min，接种于BHK-21或Vero细胞单层，37℃.5%二氧化碳培养箱吸附1h，弃去接种物，用细胞培养液洗涤三次，然后加人维持液，置于 33℃～35℃ 5%二氧化碳培养箱中继续培养。4.2 病毒鉴定)采用反转录聚合酶链反应和荧光反转录聚合酶链反应进行病毒分离物的鉴定。接种后 2 d～3 d出现 CPE，需进行鉴定。如无 CPE,则盲传三代，仍无CPE,则判为VSV阴性。5反转录-聚合酶链反应55.1：‘试剂和材料5.1. 1 ·水泡性口炎病毒标准株新泽西型(NJ)和印第安那型(IND)标推病毒株5.1.2.Taq 酶一20.℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化5.1.3逆转录酶 AMV一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。5.1.4 RNA 抑制剂(RNasin)20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。5:1.5 dNTP(含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L)5.1.6引物．选用水泡性口炎病毒L蛋白基因较保守的序列为 PCR